SP－1 通過miR－135b／HIF－1 軸對缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

孟慶雯，楊 洋，魏俊萍，楊珊珊，黃 珊

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 ?？?570100）

心肌缺血性疾病是世界范圍內(nèi)常見的致死、致殘疾病之一[1]。心臟缺血會造成心肌細(xì)胞缺氧，線粒體氧化磷酸化過程受阻，導(dǎo)致能量代謝障礙和三磷酸腺苷（ATP）生成減少，引起典型的超微結(jié)構(gòu)和代謝改變，對心肌產(chǎn)生不可逆損傷[2]。目前，對于心肌缺血性損傷的作用機(jī)制仍未明確。特異性蛋白1（SP －1）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，與多種基因的表達(dá)相關(guān)[3]。金屬蛋白酶組織抑制劑－3 可通過EGFR ／JNK／SP －1 信號抑制乳鼠心肌細(xì)胞增殖，SP － 1 的下調(diào)能促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖[4]。MicroRNAs（miRNAs）是一種非編碼的小RNA，可通過與靶基因mRNA 的3′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，還可參與多種生物學(xué)進(jìn)程，如腫瘤發(fā)生、造血和組織損傷[5－6]。miR－135b 通過靶向CACNA1C 改善病理性心肌肥大[7]，還可改善心功能受損[8]。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF －1α）是一種核翻譯因子，在缺氧缺血性疾病中起到重要的生物學(xué)作用[9－10]，可靶向抑制HIF －1α 的表達(dá)，參與細(xì)菌性腦膜炎星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育[11]。本研究中探討了SP－1 通過miR －135b／HIF －1α 軸對缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用，為心肌缺血性疾病的治療提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細(xì)胞

儀器：ELx800TM型酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；T100 型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（q－PCR）儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品＜上海＞有限公司）；Biosciences AccuriC6型流式細(xì)胞儀（安諾倫＜北京＞生物科技有限公司）。

試劑：Dulbecco′s modified eagle medium （DMEM，北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（FBS，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素1β（IL －1β）、白細(xì)胞介素6（IL －6）酶聯(lián)免疫吸附（ ELISA）試劑盒（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司）；DCFH －DA（西格瑪奧德里奇＜上海＞貿(mào)易有限公司）；miScript ⅡRT kit（德國凱杰生物科技有限公司）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)＜北京＞有限公司）；CCK－8 檢測試劑盒（東仁化學(xué)科技＜上海＞有限公司）；HIF－1α 和GAPDH 抗體（艾博抗＜上海＞貿(mào)易有限公司）；HRP 標(biāo)記二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）； siRNA 陰性對照（siRNA），SP －1 －siRNA（si－SP－1），miR －136b mimic，mimic 陰性對照（mimic NC），miR －136b inhibitor（anti－ miR －136b），inhibitor 陰性對照（anti－NC），HIF －1α 3′－UTR 端序列構(gòu)建的野生型（WT）和突變型（MUT）報(bào)告基因質(zhì)粒，均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司構(gòu)建合成。

細(xì)胞：H9c2 細(xì)胞（美國模式培養(yǎng)物保藏所）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：H9c2 細(xì)胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%時，0.25%胰酶液消化細(xì)胞，含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，將細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，5 ×104個／孔，于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染混合液A，將siRNA，si－SP－1，miR－136b mimic，mimic NC，anti－ miR－136b，anti－NC 和氯化鈷（CoCl2，HIF－1α激活劑）分別用opti－MEM 稀釋，總體積為250 μL，siRNA 和si－SP －1 終濃度為100 nmol／L，CoCl2終濃度為50 μmol／L[12]，其余序列終濃度為50 nmol／L，混勻，室溫孵育5 min；配制轉(zhuǎn)染混合液B，10 μL Lipofectamine 2 000 加入240 μL opti－MEM 中，混勻，室溫孵育5 min。將A 液和B 液混勻，室溫孵育20 min，加入6孔板內(nèi)。細(xì)胞于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)5 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，并于正常氧含量（21% O2）或缺氧（3% O2）條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

qRT －PCR 法檢測H9c2 細(xì)胞中miR －135b 表達(dá)：收集缺氧后或轉(zhuǎn)染48 h 后的H9c2 細(xì)胞，Trizol 法提取細(xì)胞總的RNA，微量分光光度計(jì)檢測RNA 濃度。應(yīng)用miScript ⅡRT kit 將1 μg RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA。按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，配制25 μL 反應(yīng) 體 系 。 miR－135b 上 游 引 物 為 5′－CCAGGCTTCCAGTA CCATTAGG －3′，下游引物為5′－GCTTATGGCTTTTCATTCCT －3′；U6 上 游 引 物 為5′－CTCGCTTCGGCAGCACA－3′ ， 下 游 引 物 為 5′ －AACGCTTCACGAATTTGCGT－3′。反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，2－ΔΔCt法計(jì)算miR－135b 表達(dá)。

CCK －8 法檢測細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的H9c2 細(xì)胞接種于96 孔板中，5 ×103個／孔，細(xì)胞于37 ℃及5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。向每孔內(nèi)加入10 μL CCK －8 溶液，37 ℃條件下孵育3 h。利用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的吸光度。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染后的H9c2細(xì) 胞，Annexin V － FITC 和PI 室 溫 條件 下 避光孵 育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

ELISA 檢測細(xì)胞TNF －α，IL －1β，IL －6 含量：收集轉(zhuǎn)染后的H9c2 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，1 000 r／min 離心20 min，取上清液，按試劑盒說明書檢測。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）：H9c2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，移除培養(yǎng)物上清液，加入DCFH －DA（濃度為10 μmol／L），37 ℃條件 下孵育30 min，隨后移除DCFH －DA，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

蛋白質(zhì)印跡(Western Blot，WB)法檢測細(xì)胞HIF－1α蛋白表達(dá)：收集轉(zhuǎn)染后的H9c2 細(xì)胞，RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，12 000 r／min 離心取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 樣本蛋白進(jìn)行SDS－PAGE 分離，隨后將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。經(jīng)10%脫脂奶粉封閉后，加入一抗HIF－1α（1 ∶1 000 稀釋）和GAPDH（1 ∶1 500），4 ℃下過夜孵育，再加入HRP 標(biāo)記二抗（1 ∶2 500 稀釋）室溫孵育1 h 后，ECL 發(fā)光、曝光。

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR－135b 和HIF－1α靶向關(guān)系：針對HIF－1α 3′－UTR 端序列構(gòu)建野生型（WT）和突變型（MUT）報(bào)告基因質(zhì)粒。依法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將HIF －1α 的WT 和MUT 載體分別與mimic NC，miR－135b mimic 轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞中，48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 缺氧對H9c2 細(xì)胞SP－1 和miR－135b 表達(dá)的影響

結(jié)果見圖1 和表1。與0 h 相比，H9c2 細(xì)胞在缺氧條件下分別培養(yǎng)12，24，48，72 h 后，細(xì)胞內(nèi)SP －1 蛋白表達(dá)呈時間依賴性顯著升高（P ＜0.05），miR －135b 表達(dá)呈時間依賴性顯著降低（P ＜0.05）。

圖1 缺氧后H9c2 細(xì)胞中SP －1 蛋白的表達(dá)水平

表1 缺氧后H9c2 細(xì)胞中SP－1 蛋白和miR－135b 表達(dá)的變化情況（± s，n ＝3）

表1 缺氧后H9c2 細(xì)胞中SP－1 蛋白和miR－135b 表達(dá)的變化情況（± s，n ＝3）

注：與0 h 相比，a P ＜0.05。

時間0 h 12 h 24 h 48 h 72 h SP －1 蛋白表達(dá)1.032 ±0.144 1.298 ±0.071a 1.360 ±0.115a 1.552 ±0.112a 1.607 ±0.113a miR －135b 表達(dá)1.023 ±0.106 0.780 ±0.059a 0.697 ±0.071a 0.512 ±0.058a 0.445 ±0.032a

2.2 SP－1 低表達(dá)對缺氧后H9c2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

結(jié)果見表2、圖2 和圖3。與對照組(A 組)相比，缺氧組(B 組)H9c2 細(xì)胞中SP －1 的蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P ＜0.05），細(xì)胞增殖能力顯著降低（P ＜0.05）；與缺氧＋siRNA 組(C 組)相比，缺氧＋si－SP －1 組(D 組)H9c2 細(xì)胞中SP－1 的蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P ＜0.05），細(xì)胞增殖能力顯著升高（P ＜0.05）。

表2 SP －1 低表達(dá)對缺氧后H9c2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s，n ＝3）

表2 SP －1 低表達(dá)對缺氧后H9c2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s，n ＝3）

注：與A 組相比，a P ＜0.05；與C 組相比，b P ＜0.05。表3 和表4 同。

組別A 組B 組C 組D 組SP －1 蛋白表達(dá)1.021 ±0.110 1.467 ±0.055a 1.463 ±0.087 0.238 ±0.039b細(xì)胞增殖（%）100.989 ±4.948 67.242 ±3.490a 66.508 ±2.190 83.550 ±2.933b細(xì)胞凋亡（%）3.697 ±0.484 14.591 ±1.863a 15.380 ±1.176 4.668 ±0.731b

圖2 WB 法檢測H9c2 細(xì)胞中SP －1 蛋白的表達(dá)水平

2.3 SP－1 低表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞炎性因子和ROS 的產(chǎn)生

結(jié)果見圖4 和表3。與A 組相比，B 組H9c2 細(xì)胞上清液中TNF －α，IL－1β，IL－6，ROS 含量均顯著升高（P ＜0.05）；與C 組相比，D 組H9c2 細(xì)胞上清液中TNF－α，IL－1β，IL－6，ROS 含量均顯著降低（P ＜0.05）。

2.4 SP－1 低表達(dá)對缺氧后H9c2 細(xì)胞HIF－1 和miR －135b 表達(dá)的影響

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9c2 細(xì)胞凋亡結(jié)果

圖4 H9c2 細(xì)胞中ROS 水平

表3 SP －1 低表達(dá)對缺氧后H9c2 細(xì)胞炎性因子水平和ROS含量的影響（± s，n ＝3）

表3 SP －1 低表達(dá)對缺氧后H9c2 細(xì)胞炎性因子水平和ROS含量的影響（± s，n ＝3）

組別A 組B 組C 組D 組TNF－ （pg／mL）2.289±0.300 5.270±0.359a 5.284±0.561 3.901±0.354b IL－1 （pg／mL）13.387±0.954 25.060±1.212a 25.923±1.431 17.198±1.216b IL－6（pg／mL）28.556±1.761 82.707±4.550a 85.369±3.937 56.742±4.081b ROS 相對含量1.032±0.080 1.239±0.075a 1.264±1.059 1.086±0.090b

結(jié)果見圖5 和表4。與A 組相比，B 組H9c2 細(xì)胞中HIF －1α 的蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.05），miR －135b表達(dá)顯著降低（P ＜0.05）；與C 組相比，D 組H9c2 細(xì)胞中HIF－1α 的蛋白表達(dá)顯著降低（P ＜0.05），miR－135b 表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）。

圖5 SP－1 低表達(dá)對缺氧后H9c2 細(xì)胞中HIF－1 蛋白表達(dá)的影響

表4 H9c2 細(xì)胞中miR－135b 表達(dá)和HIF－1 蛋白表達(dá)（X± s，n ＝3）

2.5 miR －135b 靶向調(diào)控HIF－1 基因

miR－135b 與HIF －1α mRNA 3′－UTR 的結(jié)合位點(diǎn)見圖6。由圖7 和表5 顯示，與mimic NC 組(E 組)相比，miR －135b mimic 組(F 組)H9c2 細(xì)胞中miR－135b表達(dá)顯著升高（P ＜0.05），HIF －1α 蛋白表達(dá)顯著降低（P ＜0.05），HIF －1α－WT 熒光素酶活性顯著降低（P ＜0.05），而HIF－1α－MUT 熒光素酶活性無明顯變化（P ＞0.05）；與anti－NC 組(G 組)相比，anti－ miR －135b 組(H 組) H9c2 細(xì) 胞 中miR －135b 表 達(dá) 顯 著 降 低（P ＜0.05），HIF －1α 蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）。

圖6 miR －135b 和HIF －1 3′ －UTR 結(jié)合位點(diǎn)

圖7 miR －135b 對H9c2 細(xì)胞中HIF －1 蛋白表達(dá)的影響

表5 miR －135b 靶向調(diào)控HIF －1 基因（± s，n ＝3）

表5 miR －135b 靶向調(diào)控HIF －1 基因（± s，n ＝3）

注：與E 組相比，aP ＜0.05；與G 組相比，bP ＜0.05。

相對熒光素酶活性組別miR －135b表達(dá)HIF －1蛋白表達(dá)E 組F 組G 組H 組HIF －1 －WT 1.021 ±0.102 0.425 ±0.039a HIF －1 －MUT 1.011 ±0.101 1.108 ±0.119 1.019 ±0.101 1.742 ±0.097a 0.992 ±0.101 0.424 ±0.040b 1.037 ±0.078 0.411 ±0.031a 0.983 ±0.099 1.319 ±0.071b

2.6 anti－miR－135b 和HIF－1 激動劑對si－SP－1 轉(zhuǎn)染的缺氧H9c2 細(xì)胞中miR－135b 和HIF－1 表達(dá)的影響

結(jié)果見圖8 和表6。與si－SP －1 組(I 組)相比，si－SP －1 ＋CoCl2組(J 組)H9c2 細(xì)胞中miR －135b 表達(dá)無明顯變化（P ＞0.05），HIF －1α 蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）；與si－SP －1 ＋anti－NC 組(K 組) 相比，si－SP －1 ＋anti－miR －135b 組(L 組)H9c2 細(xì)胞中miR－135b 表達(dá)顯著降低（P ＜0.05），HIF －1α 蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）。

2.7 SP－1／miR－135b／HIF－1 軸對缺氧后H9c2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

結(jié)果見圖9 和表7。與I 組相比，J 組H9c2 細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與K 組相比，L 組H9c2 細(xì)胞增殖能力顯著降低（P ＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P ＜0.05）。

圖8 H9c2 細(xì)胞中HIF －1 的蛋白表達(dá)

表6 H9c2 細(xì)胞中miR－135b 和HIF－1 的表達(dá)（± s，n ＝3）

表6 H9c2 細(xì)胞中miR－135b 和HIF－1 的表達(dá)（± s，n ＝3）

注：與I 組相比，a P ＜0.05；與K 組相比，b P ＜0.05。下表同。

組別I 組J 組K 組L 組miR －135b 表達(dá)0.999 ±0.123 1.064 ±0.090a 1.065 ±0.100 0.206 ±0.027b HIF －1 蛋白表達(dá)1.009 ±0.117 2.220 ±0.114a 1.075 ±0.071 1.560 ±0.097b

2.8 SP－1／miR－135b／HIF－1 軸對缺氧后H9c2細(xì)胞損傷的影響

結(jié)果見圖10 和表8。與I 組相比，J 組H9c2 細(xì)胞ROS，TNF－α，IL－1β，IL－6 的含量顯著升高（P ＜0.05）；與K組相比，L 組H9c2 細(xì)胞ROS，TNF －α，IL －1β，IL －6 的含量顯著升高（P ＜0.05）。

3 討論

圖9 SP －1 ／miR －135b ／HIF －1 軸對缺氧后H9c2 細(xì)胞凋亡的影響

表7 H9c2 細(xì)胞增殖和凋亡的變化（± s，%，n ＝3）

表7 H9c2 細(xì)胞增殖和凋亡的變化（± s，%，n ＝3）

組別I 組J 組K 組L 組細(xì)胞增殖100.630 ±6.418 48.470 ±2.831a 93.753 ±6.995 63.728 ±4.192b細(xì)胞凋亡15.293 ±0.409 41.076 ±1.117a 16.970 ±0.353 35.935 ±1.776b

圖10 SP －1 ／miR －135b ／HIF －1 軸 對 缺 氧 后H9c2 細(xì) 胞ROS 水平的影響

表8 H9c2 細(xì)胞上清液中ROS 和炎性因子的含量變化（X± s，n ＝3）

心肌缺血是急性心肌梗死的常見原因，可引起不可逆的心肌損傷，包括心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷[13－14]。缺氧刺激是心血管疾病（如心肌梗死、主動脈瘤和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病）病理生理機(jī)制的重要因素[15]。缺氧促進(jìn)細(xì)胞凋亡，負(fù)責(zé)病理過程中心肌的解剖重塑[16]。缺血引起的缺氧在心肌缺血性疾病期間可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[17]。SP －1 是調(diào)控多種基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，這些基因?qū)膊〉陌l(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[18]。SP －1 可促進(jìn)缺氧后血管內(nèi)皮細(xì)胞中環(huán)氧合酶2 的表達(dá)，從而促進(jìn)環(huán)氧合酶2 在主動脈瘤和心力衰竭中的局部表達(dá)[19]。SP－1 與心臟疾病密切相關(guān)，但其對缺氧后心肌細(xì)胞損傷的作用尚不清楚。

研究表明，SP －1 與心肌細(xì)胞的增殖相關(guān)[4]，SP －1的激活與炎癥和心臟肥大相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，干擾SP －1 表達(dá)可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。miRNA是一種小的、內(nèi)源性非編碼RNA 分子。 臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)表明，miRNA 是心臟缺血的潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[21]。 此外，一些miRNA 在心肌細(xì)胞程序性死亡中起調(diào)節(jié)作用[22]。心肌梗死可上調(diào)心臟SP －1 的表達(dá)，miR－7 a／b 通過抑制SP －1 的表達(dá)在心肌梗死誘導(dǎo)的心肌缺血和心室重構(gòu)中發(fā)揮保護(hù)作用[23]。miR －135b 是心肌缺血再灌注損傷的重要調(diào)節(jié)劑[24]，其過表達(dá)改善心功能受損，抑制NLRP3 ／caspase－1 ／IL －1β途徑的上調(diào)[8]。SP －1 和HIF －1α 同時抑制缺氧狀態(tài)下人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC－1）的增殖、遷移和侵襲[25]。本研究結(jié)果顯示，SP －1 是miR －135b 和HIF －1α 的上游基因，可調(diào)控miR －135b 和HIF －1α 的表達(dá)。miR －135b 可靶向調(diào)控H9c2 細(xì)胞中HIF －1α 蛋白表達(dá)，這與SUN 等[6]的研究結(jié)果一致。

眼部的慢性低氧／復(fù)氧損傷會導(dǎo)致HIF －1α 水平上調(diào)，奧拉帕尼可通過降低HIF －1α 水平發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用[26]。抑制HIF－1α 表達(dá)可減輕低氧性肺泡上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)[27]。右美托咪定通過抑制HIF－1α抑制大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善腦缺血再灌注損傷[28]。miR －135b 過表達(dá)促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制凋亡[29]。體內(nèi)和體外心肌細(xì)胞損傷后，miR －135b 的表達(dá)均下調(diào)，miR－135b 過表達(dá)可顯著抑制ROS 的產(chǎn)生和NLRP3 ／caspase －1 ／IL －1β 炎癥通路的上調(diào)[8]。本研究結(jié)果顯示，CoCl2和anti－miR －135b 會逆轉(zhuǎn)低表達(dá)SP－1 對缺氧H9c2 細(xì)胞的保護(hù)作用。低表達(dá)SP －1 通過miR－135b 抑制HIF－1α 的表達(dá)，發(fā)揮對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，SP－1 低表達(dá)通過miR －135b／HIF－1α軸發(fā)揮對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。此結(jié)果可為進(jìn)一步明確心肌細(xì)胞損傷機(jī)制和心肌缺血性疾病的治療提供參考。后續(xù)研究中將進(jìn)一步探討SP－1 低表達(dá)通過miR －135b／HIF －1α 軸在心肌缺血性疾病動物模型中的作用。