Sitagliptin對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護作用

蘭俊　王濟緯　許榮成　陳科

【摘要】 目的 研究磷酸西格列?。⊿itagliptin）對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護作用。

方法 8周齡健康清潔級SD大鼠30只， 隨機分為假手術組（S組）、肢體缺血再灌注組（IR組）、Sitagliptin治療組（SIR組）， 各10只。實驗前給SIR組的SD大鼠喂養(yǎng)Sitagliptin， 600 mg/（kg·d）， 共3 d。采用環(huán)扎雙后肢近心端4 h后再灌注4 h的方法建立大鼠肢體缺血再灌注損傷模型。S組僅麻醉， 不阻斷后肢血供， 8 h后處死取骨骼?。枘c?。吮尽R組和SIR組， 建立大鼠肢體缺血再灌注損傷模型， 缺血4 h后再灌注4 h，?然后處死大鼠取腓腸肌標本。腓腸肌標本通過HE染色觀察腓腸肌組織。另取腓腸肌標本保持冰浴勻漿， 取上清液進行測定丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

結果 腓腸肌組織切片HE 染色顯微鏡下觀察， 發(fā)現(xiàn)S組大鼠腓腸肌組織細胞排列規(guī)則有序， 肌纖維連續(xù)無斷裂。IR組大鼠腓腸肌組織結構紊亂， 橫紋不清， 出現(xiàn)斷裂， 上述改變在SIR組得到好轉。S組SOD活性為（90.72±6.16）U/ml，?MDA水平為（41.90±11.18）nmol/（mg·prot）;IR組SOD活性為（61.04±5.37）U/ml， MDA水平為（82.25±13.39）nmol/（mg·prot）;SIR組SOD活性為（70.87±6.23）U/ml， MDA水平為（68.31±14.95）nmol/（mg·prot）。IR組及SIR組MDA水平高于S組， SOD活性低于S組;SIR組MDA水平低于IR組， SOD活性高于IR組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 Sitagliptin能減輕腓腸肌缺血再灌注損傷大鼠腓腸肌組織病變， 降低大鼠肢體缺血再灌注損傷組織內(nèi)MDA的活性、增加SOD的活性， 對肢體缺血再灌注損傷大鼠的骨骼肌具有保護作用。

【關鍵詞】 Sitagliptin;缺血再灌注損傷;骨骼肌;大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.18.089

Protective effect of Sitagliptin on limb ischemia-reperfusion injury in rats ? LAN Jun， WANG Ji-wei， XU Rong-cheng， et al. Department of Orthopaedics， Lishui Peoples Hospital， Lishui 32300， China

【Abstract】 Objective ? To study the protective effect of Sitagliptin on limb ischemia-reperfusion injury in rats. Methods ? A total of 30 healthy and clean SD rats at 8 weeks of age were randomly divided into sham operation group （S group）， limb ischemia-reperfusion group （IR group）， Sitagliptin treatment group （SIR group）， with 10 rats in each group. SD rats in SIR group were fed Sitagliptin for 3 d， 600 mg/（kg·d）. The rat model of limb ischemia-reperfusion injury was established by ligating the proximal end of both hind limbs for 4 h and then reperfusion for 4 h. S group was anesthetized without blocking the blood supply of hind limbs， and the rats were killed and their skeletal muscles （gastrocnemius） were taken 8 h later. In IR group and SIR group， the rat limb ischemia-reperfusion injury model was established， and after 4 h of ischemia and 4 h of reperfusion， the gastrocnemius muscle samples were taken from the rats. Gastrocnemius tissues were observed by HE staining. In addition， the muscle samples were kept in ice bath homogenate， and the supernatant was taken to measure the activities of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD）. Results ? Gastrocnemius muscle sections were observed under microscope after HE staining and found that the gastrocnemius tissue cells of S group were arranged regularly and the muscle fibers were continuous without breakage. In the IR group， the gastrocnemius muscles were structurally disordered， with unclear stripes and fractures， and these changes were improved in SIR group. SOD activity and MDA level of S group were （90.72±6.16） U/ml， （41.90±11.18） nmol/（mg·prot）， which were （61.04±5.37）U/ml， （82.25±13.39） nmol/（mg·prot） in IR group， and （70.87±6.23） U/ml， （68.31±

14.95） nmol/（mg·prot） in SIR group. MDA level of IR and SIR group were higher than that of S group， and SOD activity was lower than that of S group; MDA level of SIR group was lower than that of IR group， and SOD activity was higher than that of IR group. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ? Sitagliptin can reduce the pathological changes of gastrocnemius in rats with ischemia-reperfusion injury， decrease the activity of MDA and increase the activity of SOD in rats with limb ischemia-reperfusion injury， and protect the skeletal muscle of rats with limb ischemia-reperfusion injury.

【Key words】 Sitagliptin; Ischemia-reperfusion injury; Skeletal muscle; Rat

臨床上發(fā)生肢體缺血再灌注損傷的情況比較多見， 輕者影響功能， 重者導致肢體壞死， 甚至危及生命， 因而肢體缺血再灌注損傷的防治一直是臨床和科研的關注點[1]。使用藥物預防具有良好的應用前景， 研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有減輕骨骼肌缺血再灌注損傷作用的藥物[2-6]。Sitagliptin是一種新型的降糖藥物， 最近的一些研究已經(jīng)證實， Sitagliptin對于心臟、腎臟等臟器的缺血再灌注損傷均有保護作用[7， 8]， Sitagliptin是不是也可以對骨骼肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用， 目前國內(nèi)外尚無相關研究。本課題組前期工作已經(jīng)完成了大鼠的腓腸肌缺血再灌注損傷的模型， 并利用這個模型證實了地稔預處理對大鼠肢體缺血再灌注損傷具有保護作用[9]。本組研究再利用這個模型， 通過預先給予大鼠攝入Sitagliptin的方法研究Sitagliptin是否對大鼠的腓腸肌缺血再灌注損傷具有保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 動物 8周齡健康清潔級SD大鼠30只（質量200～250 g）， 雄雌不限， 由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。許可證號：SYXK（浙）2010-0150。實驗前進行適應性飼養(yǎng)， 手術操作前12 h禁食， 自由飲水。分組：SD大鼠隨機分為假手術組（S組）、肢體缺血再灌注組（IR組）、Sitagliptin治療組（SIR組）共3組， 各10只。實驗操作以每組為一小單元， 每個小單元內(nèi)實驗動物接受操作的順序由抽簽決定。

1. 2 藥物和儀器 Sitagliptin（商品名：捷諾維， 杭州默沙東制藥有限公司， 規(guī)格：100 mg/片）。南京SOPTOP舜宇ST60顯微鏡， Heraeus Labofuge 400高速冷凍離心機， 上海手術器械廠800型離心機， 南京建成生物工程研究所提供的MDA和SOD檢測試劑盒， 北京長風儀器儀表公司生產(chǎn)的水浴鍋， 上海光學儀器廠生產(chǎn)的721A型分光光度計。

1. 3 方法 給藥方法：按照 Chen YT的方法[10]， 實驗前給SIR組的SD大鼠喂養(yǎng)Sitagliptin， 藥物劑量

600 mg/（kg·d）， 共3 d， 使用生理鹽水溶解成10%的溶液后喂養(yǎng)。

手術方法：大鼠術前12 h禁食， 自由飲水， 術前使用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉， 每2 h追加1次半量維持麻醉。麻醉成功后， 將大鼠取仰臥位， 四肢使用繩子固定于木板上， 頭部利用橡皮帶保持合適張力通過上頜部牙齒固定在木板上。S組僅麻醉， 不阻斷后肢血供， 8 h后處死取腓腸肌標本。IR組和SIR組， 使用橡皮止血帶環(huán)繞結扎雙后肢根部阻斷血流， 并以作者以往改進的方法， 以棉簽桿為杠桿調(diào)整松緊度[9]，?逐步增加壓力， 阻斷側支循環(huán)， 使后肢急性缺血趾蒼白， 溫度降低;4 h后松解結扎， 使后肢顏色恢復紅潤， 制成缺血再灌注模型;恢復血流灌注4 h后處死取腓腸肌標本。

標本采集：每組大鼠分別取后肢腓腸肌組織約200 mg左右， 用冰生理鹽水沖洗， 濾紙拭干后稱重， 留待監(jiān)測MDA水平及SOD的活性。剩余腓腸肌標本取約5 mm×5 mm×2 mm組織， 置于40 g/L中性福爾馬林中固定24 h。

MDA水平及SOD的活性檢測：大鼠肢腓腸肌組織， 按照1∶9的重量比例加入勻漿介質， 保持冰浴下將骨骼肌勻漿5 min， 得到10%勻漿液。將勻漿液用低溫離心機離心2000 r/min， 10～15 min后， 棄去沉淀， 取上清液進行測定。采用比色法檢測組織勻漿上清中的MDA水平及SOD的活性。

HE染色觀察腓腸肌組織病變：取福爾馬林中固定24 h后的標本， PBS清洗3次， 30%、50% 和70% 的酒精依次脫水， 10 min/次。然后于脫水機中進行脫水， 石蠟包埋后再切片。最后按照HE 染色液操作說明進行染色， 顯微鏡下觀察心肌組織病變情況。

1. 4 統(tǒng)計學方法 SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

腓腸肌組織切片HE 染色顯微鏡下觀察， 發(fā)現(xiàn)S組大鼠腓腸肌組織細胞排列規(guī)則有序， 肌纖維連續(xù)無斷裂。IR組大鼠腓腸肌組織結構紊亂， 橫紋不清， 出現(xiàn)斷裂， 上述改變在SIR組得到好轉。

S組SOD活性為（90.72±6.16）U/ml， MDA水平為（41.90±11.18）nmol/（mg·prot）;IR組SOD活性為（61.04±5.37）U/ml， MDA水平為（82.25±13.39）nmol/（mg·prot）;SIR組SOD活性為（70.87±6.23）U/ml， MDA水平為（68.31±14.95）nmol/（mg·prot）。IR組及SIR組MDA水平高于S組，?SOD活性低于S組;SIR組MDA水平低于IR組， SOD活性高于IR組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

人體骨骼肌組織對缺血較為敏感， 在運動損傷及創(chuàng)傷、應用止血帶時間過長、動脈栓塞及血栓形成等情況時， 發(fā)生缺血再灌注損傷的幾率很高。下肢缺血再灌注損傷除了導致原發(fā)部位骨骼肌的溶解、壞死， 還可波及到遠處的非缺血的心、腦、肝、肺、腎等器官造成損傷。表現(xiàn)為組織水腫、毛細血管擴張充血、炎性細胞浸潤、血管內(nèi)皮細胞損傷、細胞腫脹、變性、凋亡甚至組織壞死等等。所以發(fā)生骨骼肌缺血再灌注損傷后， 輕者影響功能;重者可導致肢體壞死、全身炎癥反應綜合征， 甚至多臟器功能衰竭（MODS）， 進而危及生命[1]。

近年來骨骼肌缺血再灌注損傷的防治研究已取得了較多的進展， 發(fā)現(xiàn)了許多物理治療和藥物介入的方法， 都有減少IR損傷的作用。物理防治的辦法， 比如高壓氧、低溫療法、低劑量的激光治療、缺血的預處理及后處理均被證實能減輕骨骼肌的缺血再灌注損傷。使用藥物預防具有更加良好的應用前景， 到目前為止發(fā)現(xiàn)許多具有減少骨骼肌缺血灌注再損傷的藥物， 比如右美托嘧啶、亞硝酸鹽、一氧化碳、一氧化氮、硫酸葡聚糖、泊洛沙姆188、N-乙酰半胱氨酸、水飛薊素、甘草甜酸、伊索前列素、前列地爾、曲馬多等藥物， 均具有減少骨骼肌缺血灌注再損傷的作用[2-6， 9]。這些藥物作用機制多樣， 包括對抗活性氧自由基、保護細胞膜、降低中性粒細胞的活性、抑制環(huán)氧化酶和脂氧合酶途徑等。

Sitagliptin是默克公司生產(chǎn)的二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑， 是一種新型的降糖藥物， 最近的一些研究已經(jīng)證實， Sitagliptin對于心臟、腎臟等臟器的缺血再灌注損傷均有保護作用， 這種保護作用與胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1， GLP-1）的增加有關[7， 8]。骨骼肌組織也有豐富的GLP-1的受體， Sitagliptin是不是也可以對骨骼肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用， 目前國內(nèi)外尚無相關研究。

活性氧自由基（Reactive oxygen species， ROS）和活化的中性粒細胞是骨骼肌缺血再灌注時造成原位和遠隔器官損傷的主要因素?；钚匝踝杂苫饕ǔ趸镪庪x子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（-OH）、次氯酸（HClO）和一氧化氮衍生的過氧亞硝基陰離子。組織缺血再灌注損傷時， 產(chǎn)生了過量的活性氧自由基， 遠遠超出了抗氧化防御體系的清除能力， 導致抗氧化酶比如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）明顯減少。此外， 活性氧明顯增加周圍組織的脂質過氧化反應[11]。脂質過氧化物可分解為醛， 如丙二醛（malondialdehyde， MDA）， 它是雙功能基化合物， 能與蛋白質、核酸、腦磷脂等含氨基化合物起反應， 使之發(fā)生交聯(lián)、喪失功能;亦可使某些含疏基的酶失活， 最終導致細胞功能衰竭、凋亡[11]。因而SOD和MDA的活性水平可以反應組織缺血再灌注損傷的嚴重程度， SOD的下降和MDA的升高提示更加嚴重的組織缺血再灌注損傷， 反之亦然。

本組研究通過預先給予大鼠攝入Sitagliptin， 再通過建立缺血再灌注損傷模型研究Sitagliptin能否對大鼠的腓腸肌缺血再灌注損傷具有保護作用。研究結果顯示， 大鼠的肢體缺血再灌注損傷后， 通過HE染色， 光鏡下組織觀察可見腓腸肌損傷， 使用Sitagliptin能緩解組織損傷。腓腸肌內(nèi)MDA活性增加， SOD的活性下降;預先應用Sitagliptin能使缺血再灌注損傷大鼠的腓腸肌組織MDA的下降， SOD的活性增加。上述表明Sitagliptin對大鼠腓腸肌的組織缺血再灌注損傷均由保護作用。

本組研究已經(jīng)證實Sitagliptin對大鼠腓腸肌的組織缺血再灌注損傷具有保護作用。但這種保護作用， 是不是像Sitagliptin對心肌的保護作用一樣， 跟胰高血糖素樣肽1的增加有關有關， 還需要后續(xù)的研究證實。

綜上所述， Sitagliptin能降低大鼠肢體缺血再灌注損傷組織內(nèi)MDA的活性、增加SOD的活性， 對肢體缺血再灌注損傷大鼠的骨骼肌具有保護作用。其更加詳細的作用機制需要進一步的深入研究。

參考文獻

[1] Ricardo O， Daniele M， Maria C， et al. Ischemia/Reperfusion Injury Revisited： An Overview of the Latest Pharmacological Strategies. Int J Mol Sci， 2019， 20（20）：5034.

[2] Dong X， Xing Q， Li Y， et al. Dexmedetomidine protects against ischemia-reperfusion injury in rat skeletal muscle. J Surg Res， 2014， 186（1）：240-245.

[3] Ball CJ， Reiffel AJ， Chintalapani S， et al. Hydrogen sulfide reduces neutrophil recruitment in hind-limb ischemia-reperfusion injury in an L-selectin and ADAM-17-dependent manner. Plast Reconstr Surg， 2013， 131（3）：487-497.

[4] Kagaya N， Kawase M， Maeda H， et al. Enhancing Effect of Zinc on Hepatoprotectivity of Epigallocatechin Gallate in Isolated Rat Hepatocytes. Biological & Pharmaceutical Bulletin， 2002， 25（9）：1156-1160.

[5] Rodríguez-Lara SQ， Trujillo-Rangel WA， Castillo-Romero A， et al. Effect of Telmisartan in the Oxidative Stress Components Induced by Ischemia Reperfusion in Rats. Oxid Med Cell Longev， 2019（1）：13.

[6] Bagis Z， Ozeren M， Buyukakilli B， et al. Effect of iloprost on contractile impairment and mitochondrial degeneration in ischemia-reperfusion of skeletal muscle. Physiol Int， 2018， 105（1）：61-75.

[7] Amin A， Nikoletta A， Renáta S， et al. Novel Potentials of the DPP-4 Inhibitor Sitagliptin against Ischemia-Reperfusion （I/R） Injury in Rat Ex-Vivo Heart Model. Int J Mol Sci， 2018， 19（10）：3226.

[8] Vaghasiya J， Sheth N， Bhalodia Y， et al. Sitagliptin protects renal ischemia reperfusion induced renal damage in diabetes. Regul Pept， 2011， 166（1-3）：48-54.

[9] 許榮成， 王濟緯， 蘭俊， 等. 地稔預處理對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護作用. 中國中西醫(yī)結合外科雜志， 2018， 24（3）：309-312.

[10] Chen YT， Tsai TH， Yang CC， et al. Exendin-4 and sitagliptin protect kidney from ischemia-reperfusion injury through suppressing oxidative stress and inflammatory reaction. J Transl Med， 2013（11）：270.

[11] Gillani S， Cao J， Suzuki T， et al. The effect of ischemia reperfusion injury on skeletal muscle. Injury， 2012， 43（6）：670-675.

[收稿日期：2020-03-04]