SIRT1/SIRT3信號軸基因表達(dá)的影響

李方暉+肖琳+覃飛+劉承宜

摘要：觀察8周中等強度低負(fù)荷量訓(xùn)練對老齡雌性大鼠腓腸肌Bax和Bcl-2蛋白水平及去乙?；?(SIRT1)/去乙酰化酶3(SIRT3)軸基因信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)的影響。16只18月齡雌性SD大鼠隨機分為對照組和運動組(各8只)。運動組在跑臺上以15 km/h(60%~75%VO2max)進行有氧運動，15 min/d，5 d/周，持續(xù)運動8周；對照組自由生活。第8周末運動后24 h宰殺并測定腓腸肌指數(shù)、蛋白免疫印跡法測定腓腸肌Bax和Bcl-2蛋白水平；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測定SIRT3、SIRT1、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子-1α(PGC-1α)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)和核呼吸因子1(NRF1) mRNA水平。結(jié)果顯示，運動組腓腸肌質(zhì)量(P<0.05)和腓腸肌指數(shù)均顯著增加(P<0.01)、Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平和Bcl-2/Bax值顯著增加(P<0.05)；運動組SIRT3、SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM、MnSOD mRNA水平顯著增加(P<0.05)，Caspase-3 mRNA水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明：中等強度低負(fù)荷訓(xùn)練可延緩老齡雌性大鼠肌細(xì)胞凋亡信號的改變；SIRT1/SIRT3軸介導(dǎo)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制在中等強度低負(fù)荷訓(xùn)練提升老齡大鼠骨骼肌線粒體更新速率及抗氧化酶水平起重要作用。

關(guān)鍵詞：運動生物化學(xué)；運動訓(xùn)練；骨骼??；第三類去乙?；?；內(nèi)穩(wěn)態(tài)；老齡大鼠

中圖分類號：G804.7文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1006-7116(2014)04-0140-05

Effects of 8-week medium intensity low load training on proteins Bax and Bcl-2 and the gene expression of signal axis SIRT1/SIRT3 of skeletal muscle of

aged female rats

LI Fang-hui1，XIAO Lin1，QING Fei2，LIU Cheng-yi2

（1.School of Physical Education and Health，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China；

2.Laboratory of Laser Sports Medicine，South China Normal University，Guangzhou 510006，China)

Abstract: In order to observe the effects of 8-week medium intensity low load training on the levels of proteins Bax and Bcl-2 and the gene messenger RNA (mRNA) expression of axis sirtuin 1 (SIRT1)/sirtuin 3 (SIRT3) of gastrocnemius of aged rats, the authors divided 16 18-month old female SD rats randomly into a control group and an exercise group, each of which contained 8 rats, let the rats in the exercise group do an aerobic exercise on a treadmill for consecutive 8 weeks, at a speed of 15 km/h (with 60%~75%VO2max), 15 minutes a day, 5 days a week, let the rats in the control group live freely, in 24 hours after rat exercising at the end of week 8, killed the rats, measured gastrocnemius index, measured the levels of proteins Bax and Bcl-2 of gastrocnemius by means of Western blot analysis, measured the mRNA levels of SIRT3, SIRT1, manganese superoxide dismutase (MnSOD), Caspase 3, peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1 (PGC-1α), mitochondrial transcription factor A (TFAM) and nuclear respiratory factor 1 (NRF1) by means of RT-PCR, and revealed the following findings: as for the rats in the exercise group, their gastrocnemius mass and gastrocnemius index increased significantly (P<0.05 and P<0.01 respectively), their protein Bax level decreased significantly (P<0.05), their protein Bcl-2 level and Bcl-2/Bax ratio increased significantly (P<0.05); their mRNA levels of SIRT3, SIRT1, PGC-1α, NRF1, TFAM and MnSOD increased significantly (P<0.05), their mRNA level of Caspase-3 decreased significantly (P<0.05). The said findings indicated the followings: medium intensity low load training could delay the changing of muscle cell apoptosis signal of aged rats; the homeostatic mechanism mediated by axis SIRT1/SIRT3 played an important role in medium intensity low load training increasing the mitochondria refreshing rate and antioxidase level of skeletal muscle of aged rats.

endprint

Key words: sports biochemistry；sports training；skeletal muscle；type 3 sirtuins；homeostasis；aged rat

肌肉衰減綜合癥(Sarcopenia)作為一種以骨骼肌質(zhì)量和肌力衰減為主要特征的增齡性機能退化征，長期以來為人們所忽視[1]。Sarcopenia引發(fā)的骨質(zhì)減少、運動平衡能力下降將增加肢體殘疾、心血管病變、心理疾病等發(fā)生幾率[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近13%的60歲以上的老年人受Sarcopenia困擾，該比例在80歲以上老人高達(dá)50%[3]。肌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為在Sarcopenia發(fā)展進程中起關(guān)鍵作用[1，4]。弱化肌細(xì)胞凋亡信號、阻止肌細(xì)胞大范圍地進入凋亡程序是延緩Sarcopenia發(fā)生重要機制[4]。文獻報道，體力活動不足是Sarcopenia誘因之一，而運動能延緩骨骼肌衰老[5]，這與體育活動能抑制衰老骨骼肌凋亡有關(guān)[6]。Song等[6]研究發(fā)現(xiàn)，中等強度大負(fù)荷量運動后老齡大鼠腓腸肌凋亡顯著減少。Pasini等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，8周大強度運動使18月齡大鼠Sarcopenia得到明顯改善，而這與線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性增加有關(guān)。漆正堂等[1]研究同樣證實，8周耐力運動可通過調(diào)控線粒體功能來拮抗Sarcopenia肌細(xì)胞凋亡。最新研究發(fā)現(xiàn)，中等強度低負(fù)荷量訓(xùn)練(Low-loads Medium-intensity Exercise，LME)可用于Sarcopenia的防護[5]，但缺乏深入的機理研究。

III型組蛋白去乙?；讣易?Sirtuins，SIRTs)是乙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotimide Adenosine Dinucleotide+，NAD+)依賴的去乙?；?。SIRTs包括7個成員。其中，盡管SIRT1和SIRT3分別位于細(xì)胞核和線粒體中，但在調(diào)控線粒體功能中具有協(xié)同作用[8]。Brenmoehl等[9]將之稱為SIRT1/SIRT3雙重調(diào)控軸。本研究在觀察8周LME對18月齡雌性大鼠骨骼肌凋亡相關(guān)因子表達(dá)影響的基礎(chǔ)上，探討SIRT1/SIRT3軸對肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制，為體育運動防護Sarcopenia提供理論依據(jù)。

1實驗對象與方法

1.1實驗動物分組、運動方案及取材

16只18月齡雌性SD大鼠購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心，體質(zhì)量為(378±11) g。在室溫20~24 ℃、光照時間07：00~19：00，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和運動組(各8只)。負(fù)荷強度參照Bejma等[10]18月齡大鼠訓(xùn)練負(fù)荷進行。運動組進行為期8周、速度15 m/min、坡度5°，每天15 min跑臺運動。負(fù)荷強度對18月齡大鼠來說相當(dāng)于60% ~75%VO2max[10]。8周最后一次運動后24 h后將大鼠麻醉處死取材，取大鼠后肢腓腸肌，腓腸肌指數(shù)的計算：腓腸肌指數(shù)=[腓腸肌質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)][7]。

1.2信使核糖核酸測定

每組取6個樣本。加入1 mL的Trizol進行總RNA提取。按試劑說明書操作步驟提取細(xì)胞總RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)。試劑購于大連寶生物公司。去乙?；?(Sirtuin 3，SIRT3)、去乙?；?(Sirtuin1，SIRT1)、錳超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase，MnSOD)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α (Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ Coactivator-1，PGC-1α)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Mitochondrial Transcription Factor A，TFAM)和核呼吸因子(Nuclear Respiratory Factor 1，NRF1)擴增引物見文獻[11]。β-actin作為內(nèi)參，并根據(jù)公式2-△△Ct計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.3蛋白免疫印跡

蛋白提取與濃度測定后離心5 min轉(zhuǎn)至-80 ℃保存?zhèn)溆谩ax、Bcl-2分離膠濃度為8%。麗春紅預(yù)染后，用1%TBST配置5%的脫脂牛奶對NC膜封閉2 h。分別用5%脫脂牛奶和5% BSA配置Bax和Bcl-2的一抗4 ℃搖床過夜。內(nèi)參為GAPDH。目的條帶的二抗均孵育2 h，洗膜后X射線膠片曝光顯影。詳細(xì)操作見文獻[6]。

1.4數(shù)據(jù)處理及分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”( ±s)表示，統(tǒng)計分析用SPSS17.0軟件完成，組間比較采用獨立樣本T檢驗，P<0.05表示統(tǒng)計具有顯著性意義。蛋白免疫印跡使用Image-ProPlus6.0進行灰度分析。

2結(jié)果及分析

2.1運動大鼠腓腸肌指數(shù)的改變

表1顯示，8周后，與對照組比較，運動組腓腸肌質(zhì)量平均增加30.0%(P<0.05)，腓腸肌指數(shù)增加37.5%(P<0.01)，但體質(zhì)量沒有顯著性差異(P>0.05)。

表1大鼠體質(zhì)量、腓腸肌質(zhì)量及腓腸肌指數(shù)( ±s)

組別 n/只 體質(zhì)量/g 腓腸肌

質(zhì)量/g 腓腸肌

指數(shù)/%

對照組

運動組 8

8 378.8±65.7

378.0±27.6 0.61±0.16

0.79±0.131) 1.6±0.20

2.2±0.112)

1)與對照組比較，P<0.05；2)與對照組比較，P<0.01

2.2運動大鼠腓腸肌Bax、Bcl-2蛋白水平及Bcl-2/

Bax值的改變

鑒于圖1顯示的GAPDH在對照組和運動組蛋白表達(dá)相對恒定，故本研究以GAPDH作為Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的內(nèi)部參照，即對照組和運動組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的灰度值分別與該組的GAPDH蛋白灰度值進行校正，將校正后的Bax和Bcl-2以及Bcl-2/Bax值分別進行比較，進而反映兩組間的蛋白表達(dá)變化。圖1、表2結(jié)果顯示，與對照組相比，運動組腓腸肌Bax蛋白減少了12.2%(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平增加12.1%(P<0.05)，Bcl-2/Bax值增加28.0%(P<0.05)。

圖1大鼠腓腸肌中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的免疫印跡圖

表2大鼠骨骼肌Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及

Bcl-2/Bax值( ±s)變化

組別 n/只 Bax/灰度值 Bcl-2/灰度值 Bcl-2/Bax比值/%

對照組

運動組 8

8 0.056 0±0.006

0.049 2±0.0011) 0.600±0.160

0.670±0.0301) 10.70±0.20

13.70±0.511)

1)與對照組比較，P<0.05

2.3運動大鼠腓腸肌SIRT1/SIRT3信號軸基因mRNA的表達(dá)改變

表3結(jié)果顯示，與對照組比較，運動組SIRT3、SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM、MnSOD mRNA水平分別增加了150%、140%、104%、380%、160%、97%，Caspase-3 mRNA減少了50%，差異有顯著性意義(P<0.05)。

表3各組大鼠骨骼肌SIRT1/SIRT3軸基因mRNA表達(dá)變化( ±s)

組別 n/只 SIRT3 SIRT1 PGC-1α NRF1 TFAM MnSOD Caspase-3

endprint

對照組

運動組 8

8 1.00±0.00

2.50±0.241) 1.00±0.00

2.41±0.631) 1.00±0.00

2.04±0.111) 1.00±0.00

4.80±0.401) 1.00±0.00

2.60±0.131) 1.00±0.00

1.97±0.41) 1.00±0.00

0.5±0.061)

1)與對照組比較，P<0.05

3討論

3.18周中等強度低負(fù)荷量訓(xùn)練對大鼠腓腸肌質(zhì)量和凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)合成減少和分解增加導(dǎo)致的肌肉質(zhì)量下降是Sarcopenia發(fā)生機制之一。力量訓(xùn)練能增加肌肉蛋白質(zhì)合成，從而延緩老年人肌肉質(zhì)量和肌力下降[12]。但也有研究認(rèn)為，耐力運動能減損力量訓(xùn)練積累起來的肌肉質(zhì)量[12]。這也使得人們對耐力運動可否用于防治Sarcopenia仍存在爭議。Pasini等[7]研究發(fā)現(xiàn)，8周中等強度大負(fù)荷量耐力運動可將18月齡雄性大鼠股四頭肌質(zhì)量增加近38%。本研究結(jié)果顯示，8周中等負(fù)荷低強度訓(xùn)練后大鼠的腓腸肌重量增加約30.0%，腓腸肌指數(shù)增加37.5%。值得指出的是，18月齡雌性大鼠到20月齡時腓腸肌質(zhì)量減少11.2%[6]。提示中等負(fù)荷低強度訓(xùn)練不僅延緩Sarcopenia骨骼肌丟失，甚至進一步增加老齡大鼠腓腸肌質(zhì)量。然而，Andersen等[13]將18月齡雌性大鼠分為運動前、9周低強度大負(fù)荷量跑臺運動組及20月齡安靜對照組。結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，與安靜組相比，18月齡雌性大鼠經(jīng)過9周運動后腓腸肌質(zhì)量雖有顯著增加，但仍明顯低于運動前。這一結(jié)果說明運動強度是體育運動對抗Sarcopenia肌肉質(zhì)量丟失的關(guān)鍵參數(shù)。

肌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為在Sarcopenia病理進程起關(guān)鍵作用[4]。Bcl-2是參與調(diào)控線粒體凋亡途徑的凋亡抑制蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。值得指出的是，當(dāng)Bcl-2/Bax值增大，細(xì)胞更趨向于存活；Bcl-2/Bax值減小細(xì)胞則趨向于凋亡[6]。圖1和表2顯示，運動組Bcl-2蛋白表達(dá)增加20%，Bax蛋白表達(dá)減少10%，Bcl-2/Bax值增加33.3%，Caspase-3 mRNA表達(dá)減少50%。Song等[6]研究也證實，與27月齡雌性安靜大鼠相比，12周中等強度大負(fù)荷量運動后的同齡大鼠腓腸肌Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax值顯著增加、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)則顯著減少。本實驗與Song等[6]采用的運動強度一致，而本研究采用低負(fù)荷量，說明負(fù)荷量是對抗Sarcopenia的非必需參數(shù)，這與上述運動強度抗肌肉質(zhì)量丟失相似。

3.2去乙?；附閷?dǎo)中等強度低負(fù)荷量訓(xùn)練的內(nèi)穩(wěn)態(tài)康復(fù)作用

功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Function-Specific Homeostasis，F(xiàn)SH)是維持功能充分穩(wěn)定發(fā)揮的負(fù)反饋機制[14]。SIRTs具有抗衰老效應(yīng)[14]。研究表明，SIRTs是FSH最貼切標(biāo)示物，存在FSH特異的SIRTs活性(FSH-Specific SIRT Activities，F(xiàn)ASAs)[14]。Baker等[15]研究表明，體育運動可促進遠(yuǎn)離FSH的功能恢復(fù)。Costford等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，老齡2型糖尿病患者骨骼肌代謝失調(diào)與SIRTs活性低于FASAs有關(guān)，而運動訓(xùn)練能將患者骨骼肌SIRTs活性康復(fù)至FASAs，提示體育運動可通過調(diào)節(jié)SIRT1維持骨骼肌FSH。

然而，骨骼肌遠(yuǎn)離FSH將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，誘發(fā)Sarcopenia[4]。肌細(xì)胞凋亡與SIRT1和SIRT3活性低于FASAs有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，中等強度低負(fù)荷訓(xùn)練可顯著增加老齡大鼠腓腸肌SIRT3和SIRT1 mRNA表達(dá)。Kang等[18]對22月齡大鼠進行12周中等強度跑臺運動干預(yù)后也發(fā)現(xiàn)，運動后大鼠骨骼肌SIRT1蛋白表達(dá)顯著高于安靜組。Lanza等[19]對59~76歲健康受試者進行為期4年、每周6 d、每天不少于1 h的中等強度耐力運動后發(fā)現(xiàn)，骨骼肌SIRT3蛋白表達(dá)增加，甚至高于青年人，提示中等強度低負(fù)荷訓(xùn)練使衰老骨骼肌SIRT3和SIRT1表達(dá)水平康復(fù)到FASAs，后者可提高凋亡閾值、抑制肌細(xì)胞凋亡。由此可見，中等強度運動是促進肌細(xì)胞SIRT3和SIRT1基因表達(dá)的必需參數(shù)。此外，研究表明，力竭運動和高強度間歇訓(xùn)練均能促進老年人骨骼肌SIRT1和SIRT3表達(dá)[20]，提示體育運動刺激SIRT1和SIRT3表達(dá)與運動方式和運動強度有關(guān)[14，21]。

3.3SIRT1/SIRT3軸雙重調(diào)控線粒體更新和抗氧化酶的表達(dá)

線粒體功能充分穩(wěn)定發(fā)揮由線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Mitochondrial Function-Specific Homeostasis，MTH)維持。維持MTH需要高水平的線粒體更新速率保證線粒體新老更替。體力活動缺乏的老年人骨骼肌代謝紊亂與線粒體遠(yuǎn)離MTH密切相關(guān)[22]。SIRT1/SIRT3軸在維持MTH過程中具有協(xié)同效應(yīng)[23]。研究表明，SIRT1/SIRT3軸可雙重調(diào)控線粒體代謝酶的活性[8]。Cantó等[11]研究證實，SIRTs催化底物NAD﹢能激活SIRT1/SIRT3軸，進而更有效地維持衰老小鼠骨骼肌MTH。然而，SIRT1/SIRT3軸任一個基因敲除都會導(dǎo)致線粒體更新受阻[24]。

線粒體更新主要由PGC-1α介導(dǎo)。PGC-1α是SIRT1/SIRT3軸下游的調(diào)控因子[25]。衰老導(dǎo)致PGC-1α活性下調(diào)將導(dǎo)致肌細(xì)胞遠(yuǎn)離MTH[26]。PGC-1α活性下調(diào)與SIRT1和SIRT3水平低于FASAs有關(guān)[23]。PGC-1α可調(diào)控下游基因表達(dá)促進線粒體生物合成，如NRF1和TFAM。NRF1進一步上調(diào)TFAM基因表達(dá)，而TFAM促進mtDNA復(fù)制[27]。本研究結(jié)果顯示，LME顯著性增加老齡大鼠腓腸肌PGC-1α、TFAM、NRF1 mRNA水平，提示LME通過上調(diào)SIRT1/SIRT3軸調(diào)控PGC-1α表達(dá)，后者促進TFAM與NRF1表達(dá)，最終維持衰老骨骼肌MTH。

MnSOD位于線粒體內(nèi)，是維持MTH抗氧化酶之一[26]。研究發(fā)現(xiàn)，MnSOD表達(dá)減少會導(dǎo)致肌細(xì)胞遠(yuǎn)離MTH[27]。MnSOD也是PGC-1α下游靶基因[28]。因此，衰老MnSOD表達(dá)減少也可能與SIRT1/SIRT3軸對PGC-1α調(diào)控缺失有關(guān)[29]。本研究結(jié)果顯示，中等強度低負(fù)荷訓(xùn)練使衰老腓腸肌MnSOD、PGC-1α、SIRT1和SIRT3 mRNA表達(dá)增加，提示中等強度低負(fù)荷訓(xùn)練可通過SIRT1/SIRT3軸雙重調(diào)控PGC-1α來促進MnSOD表達(dá)，實現(xiàn)對衰老骨骼肌MTH康復(fù)，后者將有利于阻止肌細(xì)胞進入線粒體依賴的凋亡程序。

8周中等強度低負(fù)荷量訓(xùn)練增加老齡雌性大鼠腓腸肌的Bcl-2蛋白水平和Bcl-2/Bax比值、抑制Bax蛋白和Caspase-3 mRNA表達(dá)，提示8周中等強度低負(fù)荷量訓(xùn)練可抑制老齡大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡、減少Sarcopenia肌肉質(zhì)量丟失、延緩骨骼肌衰老；SIRT1/SIRT3軸介導(dǎo)中等強度低負(fù)荷量訓(xùn)練有利于對老齡大鼠腓腸肌內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。

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