原花青素對反復(fù)力竭后大鼠骨骼肌凋亡蛋白TNF—a、Fas、caspase—8的影響

黃海峰

【摘 要】觀察原花青素對反復(fù)力竭運動后大鼠腓腸肌自由基代謝和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白TNF-a、Fas、caspase-8表達的影響。方法：建立大鼠反復(fù)力竭動物模型及原花青素藥物模型，雄性SD大鼠40只，隨機分為4組，即安靜組（C）、給藥組（M）、力竭組（E）、給藥+力竭組（ME），E組、ME組均進行四周的反復(fù)力竭跑臺訓(xùn)練。檢測力竭運動后各組大鼠骨骼肌線粒體丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）氧自由基損傷相關(guān)指標(biāo)的變化，TUNEL法檢測腓腸肌凋亡，免疫組化技術(shù)檢測腓腸肌組織中TNF-a、Fas、caspase-8蛋白水平差異表達；Real-time PCR技術(shù)檢測TNF-a、Fas、caspase-8mRNA表達水平。

【關(guān)鍵詞】原花青素；大鼠；力竭運動；骨骼??；凋亡蛋白

運動疲勞導(dǎo)致骨骼肌損傷是運動訓(xùn)練中常見的運動性疾病，其發(fā)生機制主要是訓(xùn)練時肌肉負(fù)荷過大，超過機體的承受能力，長期運動訓(xùn)練后肌肉生理機能未能得到充分恢復(fù)，導(dǎo)致運動與恢復(fù)動態(tài)平衡的失衡。研究運動疲勞致肌肉損傷的病理機制及防治措施，對我們預(yù)防運動訓(xùn)練損傷、提高訓(xùn)練及比賽成績以及在運動健身和功能恢復(fù)等領(lǐng)域，具有十分重要的意義。

本文通過研究運動過程中骨骼肌生化、酶學(xué)及相關(guān)蛋白基因表達等方面的變化，探討骨骼肌細(xì)胞凋亡及壞死發(fā)生的可能機制進行初步探討，并揭示原花青素對反復(fù)力竭運動后對大鼠骨骼肌的保護機制，為今后其在運動領(lǐng)域上的應(yīng)用提供更一定的理論支持。以期為運動損傷的預(yù)防及治療的措施提供理論依據(jù)。

一、研究對象與方法

（一）研究對象

健康SD大鼠40只，雄性，體重210g-250g，室溫控制在20-25℃，自由飲食，每籠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。

（二）研究方法

1.分組

將大鼠隨機分成4組，即安靜組（C）、給藥組（M）、力竭組（E）、給藥+力竭組（ME），每組10只。

2.給藥方案純度為95%的原花青素（購自天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司），配制成10mg/mL的原花青素水溶液，以15mL/（kg·d）對M組和ME組大鼠灌胃給藥，C組和E組按其體重灌胃15mL/（kg·d）生理鹽水。每日晨起稱重，根據(jù)體重變化，計算給藥量。

3.運動方案

參考Bedford（1979）所建立的漸增負(fù)荷運動模型（下坡跑），第一級負(fù)荷：00，8.2m/min，15min（相當(dāng)于53%V02max）；第二級負(fù)荷：50，15m/min，15min（相當(dāng)于64%VO2max）；第三級負(fù)荷：100，19.3m/min （相當(dāng)于76%VO2max），持續(xù)運動至大鼠力竭。E組和ME組大鼠，每周運動6天，休息一天，連續(xù)運動6周。運動中使用光、電、聲刺激維持運動強度。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠跑姿由蹬地式變?yōu)榉厥剑瑴粼谂艿蓝瞬荒芾^續(xù)跑動，給予聲波和光刺激均不能驅(qū)使大鼠繼續(xù)維持跑動。

4.取材

末次運動24h后，用10%的水合氯醛麻醉（0.3ml/100 g 體重），使用滅菌鑷子以摘眼球的方式取血，收集血液于10 ml 離心管中， 4℃、6000r/min 離心 10 min，小心吸取上層血清500 μl，用離心管分裝并冷凍保存于-20℃。取出腓腸肌組織，部分腓腸肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，放入4℃冰箱存儲備用，剩余部分肌肉組織保存于超低溫冰箱（-80℃）中備用。

5.細(xì)胞凋亡的檢測

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法 （terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling，TUNEL ）進行細(xì)胞凋亡檢測，TUNEL試劑盒購自于美國Promega公司。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色著染。光學(xué)顯微鏡（×400）下每張切片隨機觀察6個視野，每個視野至少 100 個細(xì)胞核水平。以 Simple PCI 顯微圖像分析軟件測試每100個細(xì)胞中的平均陽性凋亡細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（Apoptosis Index ，AI）。

6.腓腸肌組織SOD檢測

7.腓腸肌組織MDA檢測

8.腓腸肌組織蛋白印跡檢測

腓腸肌TNF-a、Fas、caspase-8蛋白測定：采用Western免疫印跡檢測。各細(xì)胞因子蛋白測試時分別取腓腸肌100mg加入組織裂解液勻漿，后離心（16000/min，30min）取上清，標(biāo)定蛋白濃度上樣后，經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳分離。將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，TBST沖洗后加一抗4℃過夜。TBST液沖洗，加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗1：3000稀釋液孵育，NBT/BCIP顯色，以各細(xì)胞因子與Beta-Actin的比值作為相對表達量。

9.R-T PCR檢測

（1）總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄

總mRNA提?。翰捎脛游锝M織RNAprep Pure Tissue Kit試劑盒，購自于天根生化科技（北京）有限公司；酸濃度測定儀（Eppendorf 德國）測定提取的總RNA濃度及吸光度值（A），均測得A值 1.9 < A260/A280 < 2.0 再行下一步實驗 ；瓊脂糖凝膠電泳顯示 28 S、18 S、5 S 三條電泳條帶，表明所提取的總RNA無降解，可作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。

mRNA的逆轉(zhuǎn)錄：準(zhǔn)備20ul的反應(yīng)體系，42℃反應(yīng)60min。70℃熱處理5min，加水稀釋至100ul，-20℃保存或者做后續(xù)實驗。

（2）Real-time PCR

儀器：ABI 7900HT，（ABI公司）試劑：SYBR R Premix Ex Taq TM（Takara）試劑盒。根據(jù)Gene Bank核酸數(shù)據(jù)庫中血管各因子cDNA序列，F(xiàn)as、caspase-8基因引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，引物均購于上海生工公司。引物合成序列如下：

TNF-a-A： 5- CAT GGA TCTCAAAGACAACAAA-3；TNF-a-B： 5-CTCCTGGTATGAAATGGCAAAT-3；

Fas-A： 5-AGCTCCTTTGGCTGCTGATCCTC-3；Fas-B： 5-CGTGAGATTGATACCAGCACTG-3；

Caspase-8-A，5-TGCCCTCAAGTTCCTGTGCTT-3；Caspase-8-B，5-TTCCTCCAACATCCCCTCTTC-3；

GAPDH-A：5-ATGACCACAGTCCATGCCATCAC-3；GAPDH-B：5-CACCTTCTTGATGTCATCATACTTG-3

（三）統(tǒng)計學(xué)分析

采用中文SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，并采用SigmaPlot10.0軟件作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，組間對比分析采用單因素方差分析方法，采用雙側(cè)t檢驗進行兩兩比較，若P﹤0.05表示為具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，若P﹤0.01表示為具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）各組大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡率

表1顯示：各組大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡率分別為：C組為1.54%、M組為1.35%、E組15.73%、ME組為3.26%。C組和M組相比沒有顯著性差異（P﹥0.05），但E組、ME組細(xì)胞凋亡率與C組有非常顯著性差異（P﹤0.01）。與M組相比，E組、ME組細(xì)胞凋亡率有非常顯著性差異（P﹤0.01）。與E組的抑制率相比，ME組細(xì)胞凋亡率有非常顯著性差異（P﹤0.01）。

（二）各組大鼠腓腸肌細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA活性

表2顯示：大鼠腓腸肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性，C組與M組以及ME組相比有顯著性差異（P﹤0.05），C組與E組相比有非常顯著性差異 （P﹤0.01）。與M組相比，E組、ME組細(xì)胞SOD活性有非常顯著性差異（P﹤0.01）。與E組腓腸肌SOD活性相比，ME組有非常顯著性差異（P﹤0.01）。大鼠腓腸肌細(xì)胞內(nèi)MDA活性，C組與M組相比沒有有顯著性差異（P﹥0.05），C組與E組相比有非常顯著性差異 （P﹤0.01），C組與ME組相比有顯著性差異 （P﹤0.05）。與M組相比，E組組腓腸肌細(xì)胞MDA活性有非常顯著性差異（P﹤0.01），ME組組MDA活性有顯著性差異（P﹤0.05）。與E組腓腸肌MDA活性相比，ME組細(xì)胞有非常顯著性差異（P﹤0.01）。

（三）各組大鼠腓腸肌組織TNF-a、Fas、caspase-8m RNA表達檢測結(jié)果

Real-time PCR結(jié)果顯示：TNF-a、Fas、caspase-8 mRNA的表達：與C組相比，E組存在顯著性差異（P<0.01），M組、ME組不具有差異性（P﹥0.05）；與M組相比，E組存在顯著性差異（P<0.01），ME組不具有差異性（P﹥0.05）；與E組相比，ME組存在顯著性差異（P<0.01）。

（四）各組大鼠腓腸肌組織TNF-a、Fas、caspase-8蛋白檢測結(jié)果

由表3和圖1可以看出，E組TNF-a、Fas、caspase-8蛋白明顯高于其他各組（P<0.01），C組和M組相比沒有顯著性差異（P﹥0.05）。TNF-a蛋白表達與M組相比，ME組有顯著性差異（P﹤0.05）。Fas蛋白表達與C組相比，ME組有顯著性差異（P﹤0.05）。

三、討論

（一）骨骼肌細(xì)胞凋亡的檢測

Podhorska-Okolow等的研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)運動的小鼠在進行一夜輪形籠自發(fā)跑步后，凋亡肌細(xì)胞明顯高于對照組，在4d后減少。Boffi等以純種馬為研究對象，對其進行3個月跑臺訓(xùn)練，跑臺運動結(jié)束后采用原位末端標(biāo)記法（TUNEL）和DNA瓊脂糖凝膠電泳的研究后發(fā)現(xiàn)，運動訓(xùn)練組的肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，推測訓(xùn)練導(dǎo)致體能增長的原因在于新生細(xì)胞不斷代替凋亡的異常肌細(xì)胞。王長青等以大鼠為研究對象，對大鼠進行了為期1d，6d，12d和18d的運動訓(xùn)練，運動訓(xùn)練結(jié)束后40min取材，用流式細(xì)胞技術(shù)和TUNEL法檢測骨骼肌細(xì)胞的凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)運動訓(xùn)練可使骨骼肌細(xì)胞凋亡的比例增加，骨骼肌細(xì)胞凋亡的比例增加明顯高于對照組，其中以訓(xùn)練6d組骨骼肌細(xì)胞凋亡的比例最高。羅吉偉，透射電鏡觀察SD大鼠研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周反復(fù)力竭運動后大鼠骨骼肌肌絲排列紊亂等壞死表現(xiàn)，核固縮等凋亡表現(xiàn)，線粒體腫脹和空泡變性等異常表現(xiàn)，且流式細(xì)胞儀檢查發(fā)現(xiàn)各運動組大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡和壞死增多。宋衛(wèi)紅等人經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)SD大鼠在跑臺，經(jīng)過3d重復(fù)性力竭運動后，骨骼肌細(xì)胞核發(fā)生了凋亡，其凋亡指數(shù)在運動后即刻明顯升高，運動后24h達到峰值。

本實驗結(jié)果表明，SD大鼠經(jīng)過6周反復(fù)力竭運動后，骨腓腸肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡，與安靜組（C）組相比，有顯著的差異。ME組細(xì)胞凋亡率高于C組和M組，但與E組相比，已經(jīng)有明顯降低。這表明，原花青素對反復(fù)力竭運動過程中大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。

（二）原花青素對反復(fù)力竭運動后大鼠腓腸肌自由基代謝的調(diào)節(jié)作用

研究表明反復(fù)力竭運動后，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，而它的大量堆積會介導(dǎo)和損傷正常的組織細(xì)胞，如細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、Ca離子超載等。自由基特點：活潑性高和氧化性極強，能通過氧化作用攻擊體內(nèi)的生物大分子物質(zhì)，使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、糖類等發(fā)生過氧化變性、交聯(lián)和斷裂，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。生物膜是由各種蛋白質(zhì)和脂類構(gòu)成，生物膜上存在各種不飽和脂肪酸，這就很容易使得生物膜成為自由基的攻擊對象，并伴隨有分解產(chǎn)物丙二醛（MDA）的產(chǎn)生。

實驗結(jié)果看出，大鼠反復(fù)力竭運動，E組和ME組腓腸肌丙二醛（MDA）含量都顯著增高，此結(jié)果與之前的研究報道相一致，說明反復(fù)力竭運動后活性氧的大量產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷，雖說ME組（MDA）含量水平增高，但是與E組相比，ME組升高水平低了很多。實驗發(fā)現(xiàn)大鼠反復(fù)力竭運動過后腓腸肌超氧化物歧化酶（SOD）活性成下降趨勢，與安靜組相比具有顯著性差異。雖然ME組腓腸肌SOD含量顯著降低，但ME組腓腸肌SOD的活性顯著高于E組。這說明反復(fù)力竭運動會導(dǎo)致活性氧過量的產(chǎn)生和堆積從而限制了抗氧化酶的活性，還可以說明原花青素一定程度上具有提高SOD活性的能力，進而抑制MDA活性，從而達到抗肌纖維活性氧損傷和維持細(xì)胞完整性的作用。

（三）原花青素對反復(fù)力竭運動后大鼠腓腸肌TNF-a、Fas、

caspase-8因子的影響

TNF-a、Fas蛋白、及死亡蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）屬于凋亡調(diào)控因子。腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員的跨膜蛋白受體，通過與相關(guān)配體結(jié)合發(fā)生寡聚化及結(jié)構(gòu)的改變，暴露出能與銜接蛋白結(jié)合的DD，聚集并激活銜接蛋白，引發(fā)下游caspase-8的活化。Fas，即CD95分子，屬于Ⅰ型膜蛋白。Fas主要以膜受體形式存在，在細(xì)胞凋亡中具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。FasL屬于細(xì)胞表面的一種Ⅱ型膜蛋白。FasL可與Fas結(jié)合，最終會引起胞質(zhì)內(nèi)前半胱胺酸天冬酶8（Procaspase-8）分子激活，而后激活的caspase-8進一步自我激活啟動下游的Caspase相關(guān)蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另一方面激活的Caspase-8也可將位于胞漿的Bid切割成截斷的Bid（tBid），tBid有很強的促凋亡活性，再次作用于線粒體釋放Cytc，通過Caspase-9/3發(fā)揮促凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)，一次性大負(fù)荷運動后會引起大鼠腓腸肌細(xì)胞TNF-α、FAS蛋白表達顯著升高。鄔卓文，研究發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)過22d力竭游泳運動后會導(dǎo)致血清TNF-α的升高。姜振等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)過急性力竭運動后，F(xiàn)as的mRNA水平明顯增高。陳筱春研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6周跑臺后大鼠Caspase-8水平明顯升高。大負(fù)荷、一次性力竭或是反復(fù)力竭運動后TNF-a、Fas、caspase-8因子的表達水平異常升高，這與本研究結(jié)果一致。

本實驗發(fā)現(xiàn)，通過大鼠腓腸肌TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達面積和mRNA的水平比較，發(fā)現(xiàn)E組合ME組大鼠腓腸肌TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達和mRNA的水平都明顯高于安靜組和M組。C組TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達和mRNA的水平，雖然高于M組但組間不具有差異性。E組TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白表達和mRNA的水平，顯著高于ME組。結(jié)果表明，長期反復(fù)的力竭運動使得TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白和mRNA在大鼠腓腸肌內(nèi)過量表達，同時ME組的TNF-a、Fas、caspase-8因子蛋白和mRNA較M組低得多，可以推測原花青素對長期反復(fù)力竭運動導(dǎo)致的大鼠腓腸肌內(nèi)TNF-a、Fas、caspase-8因子具有抑制性作用。

【參考文獻】

[1] 王華，劉霞，楊繼紅，李華.葡萄籽原花青素抗癌活性及其機制研究進展. 安徽大學(xué)學(xué)報2012（36）： 101-108.

[2] Xu Z，Du P，Meiser P，Jacob C.Proanthocyanidins： oligomeric structures with unique biochemical properties and great therapeutic promise[J]. Nat Prod Commun 2012，7： 381-388.

[3] Bagchi D， Swaroop A， Preuss HG， Bagchi M. Free radical scavenging， antioxidant and cancer chemoprevention by grape seed proanthocyanidin： an overview[J]. Mutat Res 2014； 768： 69–73.

[4] 趙平， 張月萍， 劉俊英， 等. 原花青素分級分離[J].中國食品添加劑， 2011（ 6） ： 75-80.

[5] LELONO R A，TACHIBANA S. Bioassay-guided isolation and identification of antioxidative compounds from the bark of Eugenia polyantha[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences， 2013， 16（16）： 812-818.

[6] 高羽，董志.原花青素的藥理學(xué)研究現(xiàn)狀[J]. 中國中藥雜志. 2009，34（6）： 651-655.

[7] FRACASSETTI D，COSTA C，MOULAY L，et al. Ellagic acid derivatives，ellagitannins，proanthocyanidins and other phenolics，vitamin C and antioxidant capacity of two powder products from camu-camu fruit （Myrciaria dubia）[J]. Food Chemistry， 2013， 139（1-4）：578-588.

[8] 劇紅梅，曲梓怡，孫冬陽等.原花青素對大鼠力竭運動后不同時相肝臟自由基代謝的影響[J]. 成都體育學(xué)院學(xué)報， 2008， 34（10）：74-78.