鼠尾草酸通過激活A(yù)MPK降低游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪積累

程 靜，劉 瑩，劉垚杰，趙 江，吉洋琳，劉 東，王 浩*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是除酒精外其他因素導(dǎo)致的肝損傷，包括單純的脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化，該病與炎癥因子增加、脂質(zhì)代謝紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、2型糖尿病等密切相關(guān)[1]，脂肪的過度攝入是誘發(fā)NAFLD的重要因素[2-3]。隨著西方飲食文化的流行，NAFLD正在逐漸成為全球發(fā)病率最高的一種慢性肝病之一，據(jù)報(bào)道發(fā)展中國家NAFLD的平均患病率為15%～20%，而發(fā)達(dá)中國家的平均患病率為31%～46%，并且呈上升趨勢[4]。目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，最初認(rèn)為是由胰島素抵抗引起的，但是近幾年的研究表明由肥胖導(dǎo)致的肝脂肪積累，以及肝脂肪變性等同樣會(huì)引起NAFLD[5]。臨床上還沒有公認(rèn)的治療NAFLD的標(biāo)準(zhǔn)藥物，一些降脂藥，如他汀類藥物和奧利司他，通常具有副作用，會(huì)增加肝臟的負(fù)擔(dān)甚至?xí)?dǎo)致肝功能紊亂[6]。因此尋求一種藥食同源的天然產(chǎn)物對于輔助治療NAFLD疾病具有重要意義。

圖1 鼠尾草酸分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of carnosic acid

鼠尾草酸是一種從迷迭香中提取的雙萜類化合物（圖1），具有抗細(xì)胞突變、抗氧化、抗炎等作用[7-8]。目前鼠尾草酸抗腫瘤研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，但在降脂方面的研究較少且作用機(jī)制并不明確，前期研究表明迷迭香具有降低高脂飲食小鼠體內(nèi)膽固醇的作用[9]。游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）常被用于誘導(dǎo)高脂損傷模型，研究藥物或者天然產(chǎn)物的降脂作用[10-11]。因此本實(shí)驗(yàn)采用FFAs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞NAFLD變性模型，研究鼠尾草酸對FFAs誘導(dǎo)的肝脂肪變性的作用機(jī)制，以期為其在降脂功能產(chǎn)品中的應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞購自中國培養(yǎng)物保藏中心。

TC、TG和BCA蛋白試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green試劑盒 上海寶生物生物工程有限公司；油酸、棕櫚酸、AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate activated protein kinase，AMPK）抑制劑（6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-α]嘧啶，Compound C） 美國Sigma公司；AMPK、磷酸化AMPK單克隆抗體、β-actin 美國Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗 美國Abbkine公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基 美國HyClone公司；鼠尾草酸（純度≥90%） 湖南先偉實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；IQ5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；紫外-可見分光光度計(jì)日本島津儀器公司；倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠尾草酸和FFAs溶液的準(zhǔn)備

FFAs按照油酸：棕櫚酸（濃度比2∶1）配比配制，參照文獻(xiàn)[2]的方法。油酸和棕櫚酸使用1%牛血清白蛋白配制，配制成的儲(chǔ)備液濃度為0.1 mol/L，使用時(shí)稀釋100 倍。稱取33.243 mg鼠尾草酸加入1 mL二甲基亞砜溶液中，配制成100 mmol/L的儲(chǔ)存液，然后分別稀釋成1、5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋1 000 倍。

1.3.2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)，高脂模型的建立以及實(shí)驗(yàn)分組

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中（90%（體積分?jǐn)?shù)，下同）DMEM、10%胎牛血清、1%雙抗（含100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）），在5%二氧化碳、37 ℃、恒溫恒濕的條件下培養(yǎng)。每2～3 d傳代一次，待細(xì)胞長滿后，分別接種到實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至70%～80%且呈指數(shù)增長時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[2]。

使用FFAs處理細(xì)胞建立細(xì)胞高脂模型[12]：將培養(yǎng)瓶中長滿的細(xì)胞使用胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，并接種于實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)板中，待細(xì)胞呈指數(shù)增長時(shí)，使用1 mmol/L的FFAs溶液處理細(xì)胞24 h獲得高脂損傷模型。

實(shí)驗(yàn)共分為5 組：正常組（只用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）、FFAs組（用含F(xiàn)FAs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）、低劑量組（用含有15 μmol/L鼠尾草酸和1 mmol/L FFAs的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、高劑量組（用含有20 μmol/L鼠尾草酸和FFAs的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、抑制劑組（用含有20 μmol/L鼠尾草酸、1 mmol/L FFAs以及2 μmol/L Compound C的培養(yǎng)基培養(yǎng)）。

1.3.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）法檢測[7]。實(shí)驗(yàn)原理為：MTT可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原為紫色的甲臜結(jié)晶，其結(jié)晶可被二甲基亞砜溶解形成紫色溶液。溶液紫色的深淺可以反映細(xì)胞的存活量，活細(xì)胞數(shù)越多，顏色越深。

將細(xì)胞（1×104個(gè)/mL）接種于96 孔板，每孔100 μL，待細(xì)胞呈指數(shù)增長時(shí)，按照上述實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)試劑培養(yǎng)24 h，棄掉舊培養(yǎng)基，加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉MTT并加入150 μL二甲基亞砜溶液，充分溶解5 min，在570 nm波長處測吸光度。

1.3.4 油紅O染色

油紅O是一種脂肪染色劑，可以將細(xì)胞內(nèi)的脂肪染成紅色，在顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞染色情況，染色的油紅O可以使用異丙醇溶解后在510 nm波長處測吸光度，吸光度越高說明細(xì)胞內(nèi)脂肪含量越高。

將細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）種于6 孔板，每孔2 mL，參照Lee等[2]的實(shí)驗(yàn)方法，待細(xì)胞呈指數(shù)增長時(shí)，按上述實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞24 h，棄掉舊培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液洗2～3 次，加入細(xì)胞固定液固定細(xì)胞30 min后使用新配制的油紅O溶液染色30 min。染色完成后加入體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇溶液漂洗10～20 s，然后加入磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞4～5 次并在顯微鏡下觀察。觀察結(jié)束后使用異丙醇充分溶解5 min，在510 nm波長處檢測吸光度。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇含量的測定

將細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）種于6 孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞呈指數(shù)增長時(shí)，按上述實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞24 h，棄掉舊培養(yǎng)基。使用TC、TG試劑盒，按照說明書的方法檢測細(xì)胞內(nèi)TC、TG的含量。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測。TC、TG含量表示為μmol/mg。

1.3.6 脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)量的測定

將細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）種于6 孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞呈指數(shù)增長時(shí)，按上述實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞24 h，棄掉舊培養(yǎng)基。采用逆轉(zhuǎn)錄qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)與脂肪相關(guān)基因的表達(dá)，參照前期實(shí)驗(yàn)方法[9]。使用TRIzol提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，并使用cDNA試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于檢測脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，相關(guān)基因的序列在下表1中。按照SYBR Green試劑盒的方法，依次加入cDNA、上游引物、下游引物和SYBR Green mix試劑，然后在IQ5 qPCR儀上反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s預(yù)熱；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。使用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

表1 細(xì)胞脂肪代謝相關(guān)基因及其上、下游引物序列Table 1 Genes related to lipid metabolism and their upstream and downstream primer sequences

1.3.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

采用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)水平。使用NP-40裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，并將各實(shí)驗(yàn)組蛋白濃度調(diào)至等量。將調(diào)好濃度的蛋白質(zhì)等量上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（電泳條件：濃縮膠，100 V 30 min；分離膠，130 V 1～1.5 h）。電泳結(jié)束后在冰水浴條件下，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜并使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h。加入稀釋后的一抗，在4 ℃條件下孵育過夜，TBS-T洗后，將PVDF膜放入二抗孵育40 min，使用TBS-T清洗4 次，加ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色后在凝膠成像儀上觀察拍照，并用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.8 分子對接實(shí)驗(yàn)

PT1是一種AMPK激活劑，已經(jīng)被證實(shí)能對接到AMPK蛋白，激活A(yù)MPK從而起到降脂作用[13]。本實(shí)驗(yàn)中用于執(zhí)行分子對接的小分子PT1和鼠尾草酸的分子結(jié)構(gòu)來源于https://www.chemicalbook.com，用于對接的AMPK蛋白的PDB號(hào)為4CFH，其結(jié)構(gòu)來自于PDB數(shù)據(jù)庫（RCSB Protein Data Bank database），下載之后得到獨(dú)立的PDB蛋白結(jié)構(gòu)文件。使用DS 3.5軟件打開準(zhǔn)備好的蛋白受體和小分子，小分子配體與蛋白受體使用Discovery studio 3.5（DS 3.5 Accelrys）軟件的Prepare Ligand tool和Prepare Protein tool模塊的默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行處理。使用DS 3.5軟件的CDOCKER，進(jìn)行蛋白受體與小分子的對接操作，并使用下列參數(shù)：Top Hits-10、Random Conformations-10、Orientations to Refine-10、Force fi eld-CHARMm和Use Full Potential-False。

執(zhí)行完CDOCKER后，將每個(gè)小分子的構(gòu)象與相應(yīng)的蛋白受體在Calculate Binding Energies模塊中計(jì)算配體與受體的結(jié)合能量，來評(píng)估結(jié)合體系的穩(wěn)定程度。在蛋白受體中結(jié)合能量最低的小分子配體被選作最佳構(gòu)象，用于結(jié)構(gòu)能量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析，具有代表性的實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行單因素方差分析并執(zhí)行Duncans Multiple Tests進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠尾草酸對細(xì)胞的毒性作用

與正常組相比25 μmol/L的鼠尾草酸能顯著抑制細(xì)胞的活性（P＜0.05），使細(xì)胞的活力大約降低至85%（圖2A）。Compound C 2 μmol/L處理細(xì)胞對細(xì)胞的活力無顯著性影響（圖2B）。各組與正常組相比均無顯著差異（圖2C），因此以1 mmol/L FFAs、15 μmol/L和20 μmol/L鼠尾草酸及2 μmol/L Compound C用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 鼠尾草酸對細(xì)胞活力的影響Fig. 2 Effect of carnosic acid on cell viability

2.2 鼠尾草酸對FFAs誘導(dǎo)的脂肪積累的影響

圖3 鼠尾草酸對FFAs誘導(dǎo)的脂肪積累的影響Fig. 3 Effect of carnosic acid on FFA-induced lipid accumulation in cells

鼠尾草酸對FFAs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪積累的作用如圖3所示，F(xiàn)FAs組吸光度顯著高于正常組（P＜0.05），約為正常組的2 倍。不同濃度的鼠尾草酸處理細(xì)胞后，吸光度顯著降低（P＜0.05），表明鼠尾草酸能顯著降低細(xì)胞內(nèi)脂肪含量且作用效果呈濃度依賴型。抑制劑組吸光度顯著高于高劑量藥物組（P＜0.05），這說明鼠尾草酸的降脂作用可能和AMPK相關(guān)。

2.3 鼠尾草酸對細(xì)胞內(nèi)TC、TG水平的影響

圖4 鼠尾草酸對細(xì)胞內(nèi)TC、TG水平的影響Fig. 4 Effect of carnosic acid on intracellular TC and TG levels

如圖4所示，F(xiàn)FAs處理組細(xì)胞能顯著增加TC、TG的水平，TC含量約高于正常組細(xì)胞的2 倍，TG含量約高于正常組細(xì)胞的3 倍，差異極顯著（P＜0.01）。不同濃度的鼠尾草酸處理FFAs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞，能顯著降低細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量（P＜0.05），其中TC含量從0.085 μmol/mg減低到0.05 μmol/mg，TC含量從0.142 μmol/mg減低到0.075 μmol/mg。與高劑量鼠尾草酸組相比，抑制劑組能顯著逆轉(zhuǎn)鼠尾草酸的作用且具有顯著性差異。這些結(jié)果說明在實(shí)驗(yàn)濃度下鼠尾草酸能顯著降低由FFAs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量，且這些作用與AMPK相關(guān)。

2.4 鼠尾草酸對FFAs誘導(dǎo)的脂肪相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖5 鼠尾草酸對細(xì)胞內(nèi)脂肪相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of carnosic acid on the expression of lipid metabolismrelated genes in cells

如圖5所示，F(xiàn)FAs組細(xì)胞內(nèi)SREBP-1C、FAS、ACC和SREBP-2的基因表達(dá)水平顯著高于正常組（P＜0.05），同時(shí)CPT-1和PPARα的基因表達(dá)水平顯著低于正常組（P＜0.05）。不同濃度鼠尾草酸處理HepG2細(xì)胞能顯著降低FFAs誘導(dǎo)的SREBP-1C、FAS、ACC、HMGCR和SREBP-2的基因表達(dá)水平（P＜0.05），同時(shí)鼠尾草酸能顯著增加FFAs誘導(dǎo)的CPT-1和PPARα基因表達(dá)的水平（P＜0.05），作用效果表現(xiàn)為濃度依賴型。抑制劑組能顯著逆轉(zhuǎn)鼠尾草酸誘導(dǎo)的脂肪代謝基因的變化（P＜0.05）。這些結(jié)果表明鼠尾草酸能顯著上調(diào)FFAs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中脂肪氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平和下調(diào)脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而降低細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累，且這些作用與AMPK密切相關(guān)。

2.5 鼠尾草酸對FFAs誘導(dǎo)的磷酸化AMPK蛋白表達(dá)的影響

圖6 鼠尾草酸對細(xì)胞內(nèi)磷酸化AMPK蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of carnosic acid on the protein expression of p-AMPK

由圖6可知，與正常組相比，F(xiàn)FAs組AMPK磷酸化蛋白的表達(dá)無顯著差異，而不同濃度的鼠尾草酸處理HepG2細(xì)胞能顯著上調(diào)AMPK磷酸化蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05），說明鼠尾草酸能激活A(yù)MPK的磷酸化。Compound C處理細(xì)胞能顯著抑制AMPK的磷酸化蛋白的表達(dá)，降至高劑量組的50%（P＜0.05）。上述結(jié)果表明鼠尾草酸能激活A(yù)MPK蛋白的磷酸化。

2.6 鼠尾草酸與AMPK分子對接結(jié)果分析

圖7 鼠尾草酸與AMPK分子對接結(jié)果分析Fig. 7 Analysis of docking results between carnosic acid and AMPK

如圖7所示，分析了3 個(gè)主要的參數(shù)：小分子與4CFH位點(diǎn)的結(jié)合能量，相關(guān)氨基酸殘基以及氫鍵結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸。PT1是AMPK的一個(gè)激活劑，在本實(shí)驗(yàn)中作為對接實(shí)驗(yàn)的陽性對照，被對接到4CFH位點(diǎn)。結(jié)果顯示鼠尾草酸和PT1同樣可以被對接到4CFH位點(diǎn)，且共享7 個(gè)殘基，分別為：LYS 261、ASP 128、ARG 263、ILE 259、ARG 132、LYS 260、GLU 232；PT1、鼠尾草酸與4CFH的結(jié)合能量分別為-821.25 kJ/mol和-180.994 kJ/mol；氫鍵結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基分別為ARG 263、ARG 132和GLU 232、ARG 132。這些結(jié)果表明鼠尾草酸與PT1以類似的方式結(jié)合到4CFH位點(diǎn)，因此鼠尾草酸和PT1可能有同樣的生物活性，能激活A(yù)MPK蛋白的表達(dá)，這與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討 論

FFAs能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累，過量的脂肪積累能夠引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡等[11]。研究表明FFAs在肝中大量積累會(huì)引起機(jī)體內(nèi)TC、TG含量的升高從而導(dǎo)致NAFLD疾病，并且該疾病的嚴(yán)重程度與脂肪的積累程度相關(guān)[14]。有研究報(bào)道1 mmol/L的FFAs處理細(xì)胞24 h能在對細(xì)胞無毒性作用下誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪積累[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇1 mmol/L FFAs處理細(xì)胞24 h。Compound C是AMPK的抑制劑，可以直接抑制AMPK的表達(dá)，有研究報(bào)道稱，使用Compound C 10 μmol/L處理細(xì)胞24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[16]，但在本實(shí)驗(yàn)中，大于2 μmol/L Compound C處理細(xì)胞24 h能顯著抑制細(xì)胞的活性，而2 μmol/L Compound C對細(xì)胞活性沒有影響且可以抑制AMPK蛋白的表達(dá)，這可能是由于細(xì)胞代數(shù)等原因引起的差異，本實(shí)驗(yàn)最終選用Compound C的濃度為2 μmol/L。

細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小于20 μmol/L的鼠尾草酸對細(xì)胞的活性沒有顯著影響，而25 μmol/L的鼠尾草酸能顯著抑制細(xì)胞的活性，因此選用15、20 μmol/L的鼠尾草酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。油紅O染色在實(shí)驗(yàn)中常用來反映細(xì)胞或者組織中脂肪含量，它可以使細(xì)胞內(nèi)脂滴呈現(xiàn)出紅色[17]。本實(shí)驗(yàn)中油紅O染色的結(jié)果顯示，F(xiàn)FAs處理后，細(xì)胞內(nèi)脂肪含量顯著增加（P＜0.05）；而鼠尾草酸處理后，細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量顯著降低，這些結(jié)果表明鼠尾草酸能夠降低FFAs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪的積累。細(xì)胞內(nèi)TC、TG的含量與細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累密切相關(guān)，TC、TG的水平越高，脂肪積累越多[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FFAs能顯著增加細(xì)胞內(nèi)TC、TG的含量，而鼠尾草酸能顯著降低由FFAs增加的TG、TC含量，這說明鼠尾草酸能降低細(xì)胞內(nèi)TC、TG的水平從而降低細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累。而Compound C處理細(xì)胞后，油紅O染色結(jié)果表明，被鼠尾草酸降低的細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量以及細(xì)胞內(nèi)的TC、TG水平均被顯著增加（P＜0.05），這些結(jié)果表明鼠尾草酸降低脂肪積累和TC、TG含量的作用與AMPK密切相關(guān)。

為了研究鼠尾草酸在FFAs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型內(nèi)的具體降脂機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測了一些與脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平。在人體中，SREBP家族基因主要由SREBP-1C和SREBP-2組成[19]，可以分別調(diào)節(jié)甘油三酯和膽固醇的合成。SREBP-1C主要控制TG的合成，并且可以調(diào)節(jié)ACC、FAS的表達(dá)水平[20-21]。SREBP-2主要控制TC的合成，可以調(diào)節(jié)膽固醇合成相關(guān)的蛋白表達(dá)如HMGCR[16]。ACC是脂肪合成中的限速酶，可以控制脂肪的合成，另外ACC也可以合成丙二酰輔酶A，合成的丙二酰輔酶A能抑制CPT-1的表達(dá)[20]。ACC合成的產(chǎn)物丙二酰輔酶A經(jīng)過FAS催化可以延長長鏈脂肪酸進(jìn)而合成甘油三酯。PPARα在肝中高度表達(dá)，能夠促進(jìn)肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化，加速脂肪的攝取，從而起到降脂的作用[22]。CPT-1是一種載脂蛋白可以將脂肪酸運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行β氧化[18]。有研究表明，在高脂飲食小鼠中，鼠尾草酸能降低SREBP-1C、ACC、FAS的蛋白表達(dá)并且能增加PPARα的蛋白表達(dá)，從而降低小鼠肝脂肪的積累[23]。與前人的研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示鼠尾草酸可以降低由FFAs誘導(dǎo)的SREBP-1C、ACC、FAS基因表達(dá)的增加，從而降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的合成；降低由FFAs誘導(dǎo)的SREBP-2、HMGCR的基因表達(dá)的上調(diào)，從而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成；同時(shí)增加由FFAs誘導(dǎo)的PPARα、CPT-1基因表達(dá)的下調(diào)，從而促進(jìn)脂肪酸的β氧化。綜上所述，鼠尾草酸降低細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累主要是通過降低脂肪酸合成以及增加脂肪酸的氧化。

AMPK是能量代謝的總開關(guān)，能夠調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，AMPK的激活能夠改善炎癥，緩解氧化應(yīng)激，抗癌，降脂等[24]。AMPK主要通過調(diào)節(jié)下游與脂肪代謝相關(guān)的基因ACC[17]、SREBP-1C[25]、FAS、SREBP-2、HMGCR[26]、PPARα[27]、CPT-1[28]發(fā)揮其在代謝中的重要作用。在Compound C存在條件下，鼠尾草酸在FFAs誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中的降脂作用被廢除，這些結(jié)果表明鼠尾草酸的降脂作用與AMPK相關(guān)。同時(shí)蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)表明，鼠尾草酸可以顯著增加AMPK的磷酸化。有研究表明AMPK的磷酸化可以調(diào)節(jié)SREBP-1C、ACC、FAS、PPARα和CPT1蛋白的表達(dá)[16,27]。Guo Weiwei等研究表明，黃酮類化合物（pinocembrin-7-O-β-D-glucoside、pinocembrin和5-methoxy-pinocembrin-7-O-β-D-glucoside）能提高AMPK基因和磷酸化蛋白的表達(dá)；抑制SREBP-1C基因和蛋白的表達(dá)；同時(shí)能提高PPARα蛋白的表達(dá)[27]。Forbes-Hernandez等研究表明，草莓提取物處理細(xì)胞24 h能顯著提高細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化蛋白的表達(dá)，并伴隨著ACC、HMGCR蛋白水平的降低，從而降低HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累[16]。本實(shí)驗(yàn)中使用Compound C處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的AMPK磷酸化蛋白表達(dá)明顯被降低，說明AMPK磷酸化蛋白的表達(dá)受到抑制（P＜0.05）。Compound C存在時(shí)，油紅O染色結(jié)果可知，被鼠尾草酸降低的細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量被增加；同時(shí)降低的TG和TC含量以及SREBP-1C、SREBP-2、ACC、FAS、HMGCR基因的表達(dá)水平均被顯著增加，增加的PPARα、CPT-1被顯著降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明鼠尾草酸降低FFAs誘導(dǎo)的脂肪積累作用機(jī)制主要通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證AMPK和鼠尾草酸的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)使用分子對接實(shí)驗(yàn)研究了AMPK和鼠尾草酸的相互作用。分子對接經(jīng)常被用于模擬小分子與大分子之前可能的結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合方式。PT1是AMPK的激活劑，在分子對接的研究中表明，PT1可以對接到AMPK的α亞基從而激活A(yù)MPK，更進(jìn)一步在HeLa細(xì)胞研究中使用抗磷酸化AMPKα-Thr-172抗體進(jìn)行蛋白免疫印記反應(yīng)，結(jié)果顯示PT1可以促進(jìn)AMPK α亞基Thr-172的磷酸化[13]。而本實(shí)驗(yàn)研究表明鼠尾草酸與PT1小分子以類似的方式結(jié)合到AMPK蛋白，并且在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表明鼠尾草酸能促進(jìn)AMPK磷酸化蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)脂肪代謝。因此，鼠尾草酸與PT1小分子可能具有相似的作用機(jī)制，促進(jìn)AMPKα亞基Thr-172的磷酸化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)鼠尾草酸一方面能激活A(yù)MPK磷酸化，從而抑制SREBP-1C、ACC、FAS、SREBP-2、HMGCR基因的表達(dá)，達(dá)到抑制TG、TC合成的目的；另一方面能促進(jìn)PPARα、CPT1基因的表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)脂肪β氧化的作用，從而在抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪氧化兩個(gè)方面起到降低脂肪積累的作用。