植物精油及其成分對病原微生物抗菌機理的研究進展

薩仁高娃，胡文忠*，馮 可，修志龍，姜愛麗，老 瑩，李元政，龍 婭，管玉格，姬亞茹，楊曉哲

（1.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600）

圖1 精油及其成分對病原微生物的抗菌機理Fig. 1 Antimicrobial mechanisms of essential oils and their components against pathogenic bacteria

微生物對傳統(tǒng)化學(xué)物質(zhì)和藥物的耐藥性不斷增強，促使科學(xué)家們開始尋找具有廣譜抗菌活性的新型抗菌劑[1]。精油是由植物體中特化的分泌細胞合成后經(jīng)采用現(xiàn)代萃取技術(shù)分離得到的揮發(fā)油[2]。植物細胞中的分泌物存在于植物的不同器官中，包括芽、花、葉、種子、嫩枝、莖、果實、根、木或樹皮等，一般都是貯存在植物的分泌細胞、腺囊、腺道、腺毛或表皮細胞中[3]。具有廣譜抗菌活性的植物提取物通常包括利用脂吸法或溶劑萃取法直接從植物體內(nèi)提煉的凈油、經(jīng)過蒸餾法或超臨界二氧化碳法萃取的精油、利用蒸餾法萃取精油時收集的產(chǎn)物純露和這些揮發(fā)性混合物中分離得到的抗菌單體成分。凈油、精油和純露的抗菌效果源自它們含有的抗菌活性單體成分。在自然界中，植物在進化過程中產(chǎn)生具有揮發(fā)性的次生代謝物，主要作用是保護植物免受天敵（食草動物、昆蟲和微生物）的危害，也會吸引一些昆蟲來促進花粉和種子的傳播[4]。精油是一種具有強烈感官特性揮發(fā)性化合物的復(fù)雜混合物，是許多植物產(chǎn)生的次生代謝物，也被稱為揮發(fā)油[5]。精油為液態(tài)，易揮發(fā)，呈透明/有色狀，可溶于脂類和有機溶劑，密度比水低。精油的主要成分是萜類化合物，特別是單萜（C10）和倍半萜烯（C15），其中也可能存在二萜烯（C20）。精油中也有許多其他的分子存在，包括醇、醛、酚、酮、脂肪烴、無環(huán)酯或內(nèi)酯類、微量的含氮和含硫化合物等[3]。從各種芳香植物中提取的精油被認為是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)成果的重要組成部分。這些精油因抗氧化、抗菌等藥用特性和強烈的香氣而聞名，常用于食品保藏、止痛、鎮(zhèn)定、消炎、解痙和局部麻醉[4]。精油可以抑制或延緩細菌、酵母和霉菌的生長[6-8]，是一種可替代化學(xué)抗菌劑的天然抗菌劑[9]。根據(jù)目前的研究進展，精油及其成分對細菌細胞的作用機制主要包括：破壞細胞壁和細胞膜，干擾能量代謝系統(tǒng)，影響全細胞蛋白質(zhì)、DNA和代謝組，改變細胞形態(tài)，影響細胞分裂，破壞運動性，抑制生物膜形成，影響QS活性，使細胞質(zhì)凝固，干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和影響毒力等（圖1）。本文綜述了植物精油及其成分對病原微生物的抗菌機理，旨在為精油及其成分的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 精油及其成分的抗菌機理

精油的抗菌活性取決于其所含有的化學(xué)成分及具有抗菌活性的單一組分含量，這些抗菌分子可以自然存在于植物的活性成分中，也可以當(dāng)植物體受到特定的生物或非生物刺激時，被特定的酶激活，作為對外源刺激響應(yīng)的自身防御機制而合成[10]。精油的抗菌活性不是由一個特定的機制引起的，而是涉及整個細菌細胞的一連串反應(yīng)[11]。精油中單一成分的抗菌機理可能受功能基團位置的影響，單一成分對不同病原菌的作用效果可能不同，抗菌成分含量不同可能導(dǎo)致抗菌效果不同。所以，確定精油的作用模式需要進行大量研究，明確精油及其抗菌單一組分的抗菌機理，同時在多個菌株和多種微生物中對其作用模式進行研究，才能進一步對其抗菌機理進行系統(tǒng)全面的解析。

1.1 對細胞壁的影響

細菌細胞壁有維持細菌固有外形、抑制機械和滲透損傷、協(xié)助細胞運動和生長、介導(dǎo)細胞間相互作用和防止大分子入侵等生理功能。細菌細胞壁是精油作用的首要靶點。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞壁結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致細胞對精油的耐受性不同，革蘭氏陽性菌細胞壁的結(jié)構(gòu)允許疏水分子輕易穿透細胞，通常革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對精油更敏感[12]。革蘭氏陽性菌的細胞壁是由多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的肽聚糖組成（大約占細胞干質(zhì)量的90%～95%），并有脂磷壁酸和壁磷壁酸與之相連；革蘭氏陰性菌的細胞壁含有單層肽聚糖（大約占細胞干質(zhì)量的20%），不含磷壁酸，此外，在肽聚糖外覆蓋著一層稱為外膜的脂雙層膜，由脂多糖、脂蛋白、膜孔蛋白和磷脂組成（圖1）[13]。革蘭氏陽性菌細胞壁的結(jié)構(gòu)允許疏水分子輕易穿過，然而，革蘭氏陰性菌細胞壁中外膜含有脂多糖，賦予細胞親水表面，使革蘭氏陰性菌對精油和其它具有抗菌活性的疏水性天然提取物具有更強的抵抗力[3]。但精油中的酚類化合物，如百里香酚和香芹酚，能干擾外膜，釋放脂多糖[14]。精油的成分也能干擾細胞壁中的蛋白質(zhì)。反式肉桂醛能降低外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）中OmpA、OmpC、OmpR和氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達，破壞了細菌轉(zhuǎn)運和擴散的活性[15]。堿性磷酸酶是存在于細胞壁和細胞膜之間的一種酶，正常情況下在胞外不能檢測到其活性，但當(dāng)細胞壁受到破壞導(dǎo)致透性增加時，堿性磷酸酶會滲漏到胞外[16]。刁文睿[17]的研究顯示，隨著公丁香精油處理濃度增加，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的堿性磷酸酶活力增加。Muthaiyan等[18]發(fā)現(xiàn)冷榨桔子精油能誘導(dǎo)耐藥金黃色葡萄球菌細胞壁刺激因子相關(guān)基因（pbp、胞壁質(zhì)囊和肽聚糖相關(guān)基因、自溶相關(guān)基因）的表達，進而抑制細胞壁合成，并促進細胞裂解。

1.2 對細胞膜的影響

細胞膜提供的滲透性屏障對于許多細胞功能來說是必不可少的，包括能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運輸、信息識別與傳遞、細胞免疫和代謝調(diào)控等，細胞膜也是控制膨壓的必要條件[3]。疏水性是精油的典型特征，精油的疏水性使其進入細菌細胞膜而引起膜滲透性增加，破壞膜結(jié)構(gòu)，使細胞內(nèi)容物泄漏，最終導(dǎo)致細胞死亡，所以精油抗菌活性機制通常解釋為精油對細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的毒性作用[19]。細胞膜通常是精油作用最關(guān)鍵的靶點，精油通過影響膜上脂肪酸和蛋白質(zhì)而影響質(zhì)膜正常的生理功能（圖2）。

圖2 精油及其成分對病原微生物細胞膜的影響Fig. 2 Effects of essential oils and their components on pathogenic bacteria

1.2.1 對細胞膜上脂肪酸的影響

精油及其成分的疏水性使它們能夠擴散通過脂雙層膜，影響細胞膜中不飽和脂肪酸的比例，并改變其結(jié)構(gòu)[7]。當(dāng)細菌細胞暴露在亞致死環(huán)境壓力下，細胞膜組成會發(fā)生變化，保持膜完整性和功能以適應(yīng)環(huán)境改變。膜脂改變依賴于物種和環(huán)境壓力，包括飽和度、碳鏈長度、分支位置、順反異構(gòu)化和不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為環(huán)丙烷等變化。在精油亞致死濃度的處理條件下，細菌細胞膜中不飽和脂肪酸比例增加，導(dǎo)致細胞膜流動性增加，通過這種適應(yīng)機制來維持細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，增強細胞適應(yīng)性[20]。Siroli等[21]研究了亞致死濃度的百里香精油、牛至精油、香芹酚、百里香酚、檸檬醛和trans-2-己烯醛對單增李斯特菌、大腸桿菌和腸炎沙門氏菌膜脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度精油及其單體除了增加細胞膜中的不飽和脂肪酸含量，還增加反式異構(gòu)體的含量以抵抗化學(xué)壓力；兩種革蘭氏陰性菌在抗菌劑存在時，膜脂肪酸中環(huán)丙基脂肪酸含量改變；而抗菌劑處理后膜脂碳鏈長度增加被認為是用來抵消不飽和脂肪酸增加引起的膜流化效應(yīng)，這些脂肪酸改變都是為了平衡膜流動性以適應(yīng)環(huán)境壓力。然而，在高濃度精油（高于最低抑菌濃度）處理后，細胞膜中不飽和脂肪酸比例降低，導(dǎo)致膜流動性的喪失和膜硬度的增加[22]。此外，精油還可能引起細菌細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速膜脂過氧化，經(jīng)百里香酚和肉桂醛處理的單增李斯特菌的丙二醛（膜脂過氧化最終產(chǎn)物）含量顯著升高[23]。Siroli等[21]分析了精油及其成分處理后的食源性病原微生物的揮發(fā)性成分的變化，發(fā)現(xiàn)醛類、醇類、內(nèi)酯類、短鏈和中鏈脂肪酸及其酯類含量增加，這些增加的揮發(fā)性成分是氧化不飽和脂肪酸產(chǎn)生的。

1.2.2 對細胞膜上蛋白質(zhì)的影響

精油還會改變膜蛋白的滲透性和功能。富含酚類物質(zhì)的精油可以嵌入到細菌的磷脂雙層膜中，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，阻止蛋白質(zhì)執(zhí)行正常的功能[19]。假單胞菌通過去飽和酶的生物合成途徑合成不飽和脂肪酸，di Pasqua等[20]發(fā)現(xiàn)多種精油單體處理后的熒光假單胞菌細胞膜中不飽和脂肪酸比例降低而飽和脂肪酸比例增加，推斷抗菌化合物的存在可能影響去飽和酶的作用。但精油不會影響順反異構(gòu)酶，即使它通常在細胞適應(yīng)環(huán)境壓力時是活躍的[22,24]。呂飛等[25]研究顯示，0.175 μL/mL肉桂精油處理腐敗希瓦氏菌后，膜蛋白的18 kDa亞基含量增加而40 kDa亞基含量減少，0.350 μL/mL肉桂精油處理組膜蛋白的49、43 kDa亞基含量增加，且隨著精油濃度增加，膜蛋白破壞程度增加。

精油及其成分通過影響膜脂和膜蛋白，改變膜的流動性和滲透性，影響膜電位，破壞電子傳遞系統(tǒng)，導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)如離子、細胞質(zhì)、ATP、核酸和蛋白質(zhì)等泄漏，最終細胞解體死亡[26]。李娜[27]研究了紫蘇精油對大腸桿菌的抗菌機理，發(fā)現(xiàn)在精油的作用下，菌體細胞膜破壞使Na＋、K＋離子泄漏，菌懸液相對電導(dǎo)率顯著高于未處理的大腸桿菌，且精油處理使膜脂過氧化程度增加。何文兵[28]研究顯示，黃檗果實精油可使沙門氏菌細胞膜通透性和完整性發(fā)生改變，使菌液相對電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量、MDA含量升高，菌體ATP含量降低。de Sousa Guedes等[29]利用流式細胞術(shù)研究了兩種薄荷精油對菠蘿和芒果汁中大腸桿菌、單增李斯特菌和腸炎沙門氏菌的抗菌機理，結(jié)果表明精油通過多靶點的作用模式抗菌，包括破壞細胞膜，增加滲透性和電位去極化，以及抑制外排泵和呼吸活性。Yap等[30]發(fā)現(xiàn)肉桂皮精油能降低大腸桿菌細胞表面的負電荷，通過細胞膜酸化和蛋白質(zhì)變性使細胞膜發(fā)生不可逆的損傷。Cherrat等[31]首次利用熒光各向異性法測定了英諾克李斯特菌和大腸桿菌的細胞膜流動性，發(fā)現(xiàn)月桂精油使膜表面硬化，但增強了膜核心的流動性。

1.3 對能量代謝的影響

在細胞呼吸作用中，細胞膜上電子傳遞鏈產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度，這是合成ATP所必需的，這個過程由具有ATP酶活性的多種酶催化，包括ATP依賴的轉(zhuǎn)運蛋白和F1Fo-ATP酶復(fù)合物[32]。F1Fo-ATP酶是一種可逆的質(zhì)子轉(zhuǎn)運泵，它可以利用ATP水解產(chǎn)生的能量從細胞質(zhì)中泵出質(zhì)子，這種質(zhì)子外流增強了質(zhì)子梯度，并有助于調(diào)節(jié)細胞質(zhì)pH值[15]。精油能通過破壞細胞膜使ATP流失[33]，或通過干擾質(zhì)子動力、改變ATP酶構(gòu)象和抑制ATP酶相關(guān)亞基的表達，進而影響ATP合成[15]。Mutlu-Ingok等[34]利用小豆蔻、小茴香和蒔蘿草精油處理空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌，結(jié)果顯示處理后胞外ATP濃度顯著增加，說明細胞膜破壞導(dǎo)致ATP流失。Friedman等[35]發(fā)現(xiàn)經(jīng)香芹酚處理后，蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)ATP含量減少，但胞外ATP含量沒有相應(yīng)增加，通過測定膜電位以及K＋和H＋的通透性發(fā)現(xiàn)，離子梯度的喪失破壞了細胞內(nèi)的基本能量代謝過程，從而導(dǎo)致細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)反式肉桂醛使阪崎腸桿菌F1Fo-ATP酶下調(diào)，進而抑制了ATP合成[36]，并能抑制鼠傷寒沙門氏菌ATP合酶α亞基的表達[37]。Gill等[38]研究顯示5 mmol/L的丁香酚和40 mmol/L肉桂醛能抑制葡萄糖缺乏的單增李斯特菌生成ATP，而在葡萄糖豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，肉桂醛處理使單增李斯特菌胞內(nèi)ATP迅速耗盡，而丁香酚處理單增李斯特菌胞內(nèi)ATP未消耗，可能原因是丁香酚限制單增李斯特菌對葡萄糖的利用能力，抑制了F1Fo-ATP酶，并可能引起細胞離子泄漏，肉桂醛與細胞膜的相互作用是通過離子的泄漏而不是ATP等較大細胞成分的泄漏，從而分散質(zhì)子動力，導(dǎo)致胞內(nèi)ATP快速消耗。Chan等[39]利用生物發(fā)光大腸桿菌生物傳感器HB101_pUCD607_lux研究了異硫氰酸烯丙酯和肉桂醛的劑量-反應(yīng)關(guān)系及作用機制，結(jié)果表明異硫氰酸烯丙酯和肉桂醛處理的樣品生物發(fā)光量顯著降低，這是由于ATP和NADPH降低，影響了細菌的代謝活性，而不是僅僅由于細胞膜的屏障功能破壞引起ATP和NADPH的泄漏。

1.4 對蛋白質(zhì)的影響

精油中的某些成分通過作用病原菌全細胞蛋白質(zhì)，進而對病原菌的多種生命活動產(chǎn)生影響。例如，山柰精油使大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的全蛋白質(zhì)電泳結(jié)果中條帶明顯減少，且灰度減弱[40]。公丁香精油能抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌蛋白質(zhì)的合成[17]。蛋白質(zhì)作為生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)，是細菌中各種生理功能的行使者，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的手段分析抗菌劑對菌體細胞全蛋白質(zhì)譜的影響，能全面、系統(tǒng)地解析抗菌機理。Silva等[37]評估了鼠傷寒沙門氏菌生物膜細胞和肉桂醛處理的生物膜細胞表達的差異蛋白模式，發(fā)現(xiàn)肉桂醛處理后有2 種蛋白質(zhì)（RNA聚合酶α亞基和延伸因子EF-Tu）水平上調(diào)，7 種蛋白質(zhì)（烯醇化酶、ATP合酶β亞基、果糖二磷酸醛縮酶、過氧化物酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、膜蛋白和肽基脯氨酰基順反異構(gòu)酶）水平下調(diào)。Lanciotti等[41]研究了單增李斯特菌Scott A細胞對亞致死劑量的抗菌劑（乙醇、檸檬醛、香芹酚、E-2-己烯醛和百里香精油）的適應(yīng)性，與最適培養(yǎng)條件下的對照組細胞相比，經(jīng)抗菌物質(zhì)處理1 h的單增李斯特菌中有223 個蛋白點合成水平增加或減少（不低于或不高于2 倍，P＜0.05），聚類分析表明，不同處理之間的蛋白質(zhì)組譜圖不同，蛋白質(zhì)組的適應(yīng)和形成主要涉及細胞周期控制、細胞分裂、染色體、細胞運動性和調(diào)控相關(guān)蛋白、碳水化合物、丙酮酸、核苷酸和氮代謝、輔助因子和維生素以及應(yīng)激反應(yīng)。Sun Yangying等[42]采用同位素標記相對和絕對定量法以及二維液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜研究了1,8-桉葉素（0.25 mg/mL，3 h）對沙門氏菌的血清蛋白表達量的影響，闡明了1,8-桉葉素的抗菌機理，結(jié)果顯示，1,8-桉葉素對沙門氏菌細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)有明顯的破壞作用；實驗組共提取3 011 種蛋白，其中差異表達蛋白435 種（差異表達倍數(shù)大于1.5 倍），上調(diào)123 種，下調(diào)312 種；差異表達蛋白質(zhì)參與了935 個細胞內(nèi)生物過程、98 種細胞成分、477 個分子功能和86 個京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路，其中，與碳水化合物、核苷酸、氨基酸、脂質(zhì)和能量代謝相關(guān)的蛋白在1,8-桉葉素處理后發(fā)生顯著變化。di Pasqua等[43]采用基于雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DEs）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究了在百里香酚亞致死濃度下生長的腸炎沙門氏菌的蛋白質(zhì)表達變化，結(jié)果表明，經(jīng)百里香酚處理后，許多蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)或下調(diào)，不同功能的蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化；硫氧還蛋白-1在百里香酚處理的細胞中未表達，可能是由于百里香酚引起了細胞壓力；熱應(yīng)激保護機制的關(guān)鍵伴侶蛋白（如GroEL和DnaK）上調(diào)或合成，表明百里香酚的存在引起了腸炎沙門菌細胞的應(yīng)激反應(yīng)；細胞OMP表達上調(diào)，過多的OMP合成引起錯誤折疊OMP的積累可能導(dǎo)致細菌的包膜應(yīng)激反應(yīng)；百里香酚處理后，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)含組氨酸的磷酸載體蛋白濃度降低了一半以上；百里香酚使外膜孔道蛋白（tolerant colicin，TolC）表達上調(diào)，TolC是組成革蘭氏陰性菌耐藥性外排泵的最重要成分，表明百里香酚可能會影響腸炎沙門氏菌的耐藥能力；DNA結(jié)合蛋白H-NS和50S核糖體蛋白L7/L2在百里香酚處理后表達水平下調(diào)，而30S核糖體蛋白S1表達水平上調(diào)；百里香酚破壞了檸檬酸代謝途徑以及許多參與合成ATP的酶。

1.5 對DNA的影響

DNA是細菌在細胞物質(zhì)合成和遺傳過程中具有重要作用的遺傳信息載體，它的任何損傷都會影響遺傳物質(zhì)正常的復(fù)制及生長繁殖，而精油中的成分可以破壞DNA結(jié)構(gòu)，或抑制基因表達[19]。研究發(fā)現(xiàn)，韓茵陳（Artemisia iwayomogi）精油的主要成分vulgarone B使金黃色葡萄球菌的DNA泄漏，處理時間延長導(dǎo)致DNA裂解，同時vulgarone B能與pBR322質(zhì)粒載體DNA或λ DNA相互作用，或引起DNA損傷[44]。冷榨橘子精油能誘導(dǎo)耐藥金黃色葡萄球菌DNA代謝相關(guān)基因表達部分上調(diào)和部分下調(diào)，主要干擾的DNA代謝包括DNA復(fù)制、重組和修復(fù)，此外，橘子精油還通過影響細胞壁相關(guān)基因的表達促使細胞裂解[18]。精油引起DNA損傷的具體機制仍不清楚，還有待進一步研究。然而，Kohanski等[45]認為抗菌藥物對細菌的殺滅能力可能是藥物結(jié)合的拓撲異構(gòu)酶與裂解的DNA之間形成穩(wěn)定相互作用復(fù)合物的作用，在抗菌劑存在時，復(fù)制叉停滯導(dǎo)致DNA復(fù)制機制受阻，DNA合成受到抑制，最終導(dǎo)致細胞死亡。

1.6 對代謝組的影響

當(dāng)生存環(huán)境變化時，細菌代謝物會產(chǎn)生變化，分析環(huán)境脅迫對細菌胞內(nèi)和胞外代謝組的影響通常運用的方法有核磁共振、微陣列、氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜等[46-47]。近年來，這些技術(shù)已經(jīng)用于研究具有抑菌和/或殺菌活性的天然分子對病原菌代謝組的影響。Picone等[48]評價不同濃度香芹酚（0.67、1.33、2.00 mmol/L）對好氧條件下培養(yǎng)的大腸桿菌555細胞甲醇-水提取代謝物的影響，結(jié)果顯示，隨著香芹酚處理濃度增加，葡萄糖濃度增加，而有機酸（除甲酸鹽）濃度降低；香芹酚濃度在0～1.33 mmol/L之間時，甲酸鹽濃度隨香芹酚濃度的增加而增加，大腸桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要糖分子甲酸鹽的增加，表明代謝可能向發(fā)酵轉(zhuǎn)變，2.00 mmol/L香芹酚處理甲酸鹽濃度下降至0，表明在香芹酚濃度最高時，大腸桿菌生存能力喪失，導(dǎo)致代謝停滯，細胞中甲酸鹽消失，甲酸鹽是細胞死亡前的最后一個碳源；芳香族氨基酸的濃度在最低濃度香芹酚處理時保持不變，而在較高濃度時顯著增加，但丙氨酸不受干擾。Hossain等[49]利用固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分析了最低抑菌濃度的肉桂醛對大腸桿菌BL21代謝組的影響，研究顯示肉桂醛能影響大腸桿菌的生長和代謝，在對數(shù)生長中期代謝產(chǎn)物較多，代謝產(chǎn)物種類和濃度變化與細胞密度和肉桂醛的劑量有關(guān)，間歇加入肉桂醛（2 g/L）后，分離出約25 種不同的化合物，包括吲哚、烷烴、乙醇、有機酸和酯類等。

1.7 對細胞形態(tài)的影響

精油及其成分通過破壞細胞壁、細胞膜和引起細胞內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致細菌細胞形態(tài)的改變，甚至破損。觀察精油及其成分對細胞形態(tài)的影響主要利用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡等可視技術(shù)。Zhang Yunbin等[50]利用掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未處理的大腸桿菌細胞壁呈特殊的條紋狀，金黃色葡萄球菌細胞膜表面光滑；在經(jīng)肉桂精油處理后，大腸桿菌細胞表面呈褶皺和不規(guī)則狀，且部分細胞脹破，而金黃色葡萄球菌出現(xiàn)大量凹陷和畸形細胞。Chen Zhifen等[51]通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，呈完整光滑短桿狀的大腸桿菌經(jīng)Alpinia guilinensis精油處理后，細胞相互黏附，出現(xiàn)變形、凹陷、萎縮和破裂的現(xiàn)象；透射電子顯微鏡觀察顯示，未處理的大腸桿菌細胞完整，細胞壁和細胞膜清晰可辨，細胞質(zhì)致密且均勻分布，精油處理后細胞明顯受損，細胞壁和細胞膜破壞，細胞質(zhì)分布不均勻，部分細胞壁變厚，甚至無法分辨，說明發(fā)生了膜裂解。la Storia等[52]利用原子力顯微鏡觀察了3.3 mmol/L香芹酚處理的熱殺索絲菌1R2、麥芽糖肉食桿菌9P、植物乳桿菌48M、英諾克李斯特菌1770、大腸桿菌32、蜂房哈夫尼菌53M、莓實假單胞菌25P和變形斑沙雷菌42M的細胞表面變化，發(fā)現(xiàn)處理前細胞表面光滑均勻且未見明顯損傷，但處理后所有菌株細胞表面結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化；其中，熱殺索絲菌1R2表面出現(xiàn)明顯的凹凸不平，麥芽糖肉食桿菌9P多數(shù)細胞出現(xiàn)分裂間隔，植物乳桿菌48M和英諾克李斯特菌1770細胞頂端可見直徑約為5 nm的囊泡，麥芽糖肉食桿菌9P、植物乳桿菌48M和英諾克李斯特菌1770個別細胞邊緣出現(xiàn)塌陷區(qū)域，大腸桿菌32和莓實假單胞菌25P細胞完全塌陷到載玻片上且細胞表面出現(xiàn)皺紋和鋸齒狀（有顆粒），蜂房哈夫尼菌53M和變形斑沙雷菌42M表面嚴重變形；同時，經(jīng)香芹酚處理后的細菌長度和寬度縮短，表面粗糙度和表面積比增加。Nguyen等[53]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)山蒼子葉精油處理后，兩株大腸桿菌出現(xiàn)細胞絲化的現(xiàn)象，且長度和寬度均增加。Kwon等[54]利用掃描電子顯微鏡觀察了肉桂醛對蠟樣芽孢桿菌形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)未處理蠟樣芽孢桿菌細胞呈分離的桿狀，經(jīng)肉桂醛處理后，細胞變?yōu)榧氶L的絲狀結(jié)構(gòu)，細胞之間不分離，不完整的隔膜位于絲狀細胞之間。Oussalah等[55]利用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)過牛至、肉桂和香薄荷精油處理后大腸桿菌O157:H7和單核增生性李斯特菌的形態(tài)破損和細胞膜破壞，其中，牛至精油處理的大腸桿菌細胞壁上有孔洞或白點。

精油對革蘭氏陰性菌細胞形態(tài)的影響比對革蘭氏陽性菌強。研究顯示，香芹酚更容易影響革蘭氏陰性菌細胞的形態(tài)，幾乎所有革蘭氏陰性細菌在香芹酚處理后表面的粗糙度更顯著增加，可能因為革蘭氏陰性菌的外膜是香芹酚首要靶點；然而，通常認為革蘭氏陰性菌對精油更有抵抗力，所以革蘭氏陰性菌細胞表面結(jié)構(gòu)的改變也可以解釋為對應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，香芹酚處理可能增加了外膜成分的暴露（如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)），導(dǎo)致粗糙程度增加[52]。在革蘭氏陽性菌中，香芹酚通過肽聚糖層，然后作用于細胞質(zhì)膜上，細胞膜的結(jié)構(gòu)變化，如流動性的改變，可能會導(dǎo)致革蘭氏陽性細胞壁的外部表面發(fā)生輕微的改變，使其粗糙程度下降[56]。

1.8 對細胞分裂的影響

細菌細胞分裂由FtsZ控制，這是一種原核同源的微管蛋白[57]。依賴GTP的FtsZ在細胞分裂位點裝配形成細絲，這是一種稱為Z-環(huán)的高度動態(tài)的聚合結(jié)構(gòu)，在細胞中組裝并收縮細胞包膜，最終將母細胞分離成兩個子細胞[58]。精油的某些成分可以作用于細菌中的蛋白質(zhì)，并可能影響細胞分裂。Domadia等[59]研究顯示，肉桂醛抑制體外FtsZ的組裝反應(yīng)和鍵合，擾亂大腸桿菌體內(nèi)Z-環(huán)的形態(tài)，降低單位細胞長度Z-環(huán)的頻率，肉桂醛抑制依賴GTP的FtsZ聚合，抑制GTP水解；大腸桿菌活細胞共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，肉桂醛特異性靶向作用于Z-環(huán)空間排列，使Z-環(huán)消散，使Z-環(huán)形成的頻率降低近一半；該研究者還預(yù)測了FtsZ的肉桂醛結(jié)合區(qū)域為C末端區(qū)域的肉桂醛結(jié)合區(qū)（包括FtsZ的T7環(huán)），并假設(shè)肉桂醛與FtsZ結(jié)合，擾亂Z-環(huán)的形成，并抑制它的裝配動力。Kwon等[54]發(fā)現(xiàn)肉桂醛處理蠟樣芽孢桿菌后，細胞變成細長的絲狀結(jié)構(gòu)，子細胞不會與上代細胞分離，因為隔膜的形成是不完整的。Muthaiyan等[18]研究顯示，冷榨橘子精油能誘導(dǎo)耐藥金黃色葡萄球菌細胞分裂相關(guān)基因下調(diào)，包括divIB、ftsA、ftsL和ftsW。la Storia等[52]發(fā)現(xiàn)香芹酚處理的麥芽糖肉食桿菌9P細胞中存在分裂隔膜，可能是由于香芹酚影響了細胞分裂相關(guān)蛋白質(zhì)。

1.9 對細菌運動性的影響

運動性在宿主與微生物的相互作用中起著重要的作用，細菌的定植和毒力特性包括多個生物學(xué)過程，即信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、趨化性和鞭毛運動[15]。精油及其成分通過影響鞭毛相關(guān)蛋白質(zhì)合成，破壞運動性相關(guān)蛋白，干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，降低驅(qū)動鞭毛運動所需的質(zhì)子動力來影響細菌的運動性[3]。Amalaradjou等[36,60]進行的實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果顯示，反式肉桂醛顯著降低了阪崎腸桿菌運動性相關(guān)基因的表達，包括鞭毛結(jié)構(gòu)和生物合成相關(guān)的基因fliD、flhD和flgJ，以及鞭毛定子蛋白相關(guān)基因motA和motB，經(jīng)亞抑制濃度反式肉桂醛處理后，細菌運動性顯著降低。Burt等[61]將香芹酚和對傘花烴分別與大腸桿菌O157:H7過夜培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)1 mmol/L香芹酚處理的細菌無鞭毛且不運動，鞭毛蛋白含量顯著下調(diào)，鞭毛合成受阻，1 mmol/L對傘花烴處理的細菌有鞭毛且運動，當(dāng)對傘花烴濃度增加至10 mmol/L時，細菌不運動且鞭毛蛋白含量顯著下調(diào)；在大腸桿菌O157:H7對數(shù)生長期添加香芹酚和對傘花烴培養(yǎng)后，0.3～1.0 mmol/L香芹酚處理的細菌鞭毛蛋白含量變化不顯著，0.5、0.8、1.0 mmol/L香芹酚處理的細菌不運動，0.3～0.8 mmol/L對傘花烴處理的細菌鞭毛蛋白含量變化不顯著，0.3 mmol/L對傘花烴處理的細菌運動性降低，0.5 mmol/L和0.8 mmol/L對傘花烴處理的細菌不運動。Gill等[62]研究顯示，5 mmol/L和10 mmol/L丁香酚、香芹酚和肉桂醛均抑制了大腸桿菌和單增李斯特菌的鞭毛運動，可能是由于膜質(zhì)子梯度耗散直接抑制鞭毛運動，或由于結(jié)構(gòu)的變化，如鞭毛的喪失導(dǎo)致運動能力的喪失。van Alphen等[63]研究顯示，亞抑制濃度香芹酚處理的空腸彎曲桿菌運動性喪失，免疫印跡結(jié)果顯示香芹酚未影響鞭毛蛋白質(zhì)表達，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)香芹酚處理后的細菌鞭毛仍然存在，說明香芹酚抑制了空腸彎曲桿菌鞭毛的功能，但不影響鞭毛的合成；此外，香芹酚使空腸彎曲桿菌運動能力喪失，不是由細胞內(nèi)ATP水平的降低引起的，且香芹酚抑制了細菌對人上皮細胞的侵襲。Inamuco等[64]發(fā)現(xiàn)香芹酚能抑制鼠傷寒沙門氏菌的運動性，處理后細菌鞭毛仍然存在，且處理后鼠傷寒沙門氏菌運動能力的喪失與細胞內(nèi)ATP水平無關(guān)，香芹酚能抑制細菌對豬上皮細胞的侵襲，但不影響細菌黏附；此外，香芹酚處理鼠傷寒沙門氏菌后，宿主細胞的防御素的基因表達降低。

1.1 0 對生物膜的影響

生物膜是指細菌附著于活性或惰性實體表面形成的菌落，具有較強黏附力，一般消毒劑和抗生素很難穿透生物膜的胞外脂多糖基質(zhì)層，造成清洗和殺菌困難[65]。生物膜的形成大體分為3 個階段，即黏附、增殖/成熟和游離/傳播[66]。生物膜的形成有利于細菌存活、防止干燥、抑制抗生素在微生物細胞中的擴散和滲透、代謝合作以及通過水平基因轉(zhuǎn)移提高遺傳多樣性[15]。多種精油及其成分能影響病原微生物的生物膜。金黃色葡萄球菌在生物膜的增殖和成熟階段，會產(chǎn)生由多糖、蛋白質(zhì)和DNA等成分組成的胞外基質(zhì)，構(gòu)成金黃色葡萄球菌胞外基質(zhì)中最主要的多糖為細胞間多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA），茶樹油能減少金黃色葡萄球菌PIA的表達；同時，金黃色葡萄球菌胞外DNA影響生物膜的黏附和成熟，而茶樹油能抑制胞外DNA的釋放，進而抑制生物膜的形成，此外，茶樹油還能抑制生物膜相關(guān)基因（icaA、sarA、cidA和hlA）的表達[66]。周慧[67]研究顯示，鼠尾草精油能有效抑制不銹鋼、塑料和玻璃表面金黃色葡萄球菌生物膜的形成，且隨著精油濃度增加、作用時間延長，生物膜清除率增加。Amalaradjou等[36]研究結(jié)果表明，反式肉桂醛通過抑制胞外多糖的合成（纖維素）、鞭毛的形成和功能，以及通過減少基因表達來抑制細胞間信號傳導(dǎo)，從而減少坂阪崎腸桿菌的生物膜形成。Nostro等[68]研究顯示，清除金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌產(chǎn)生的生物膜所需要香芹酚和百里香酚的濃度是抑制浮游生物群所需要濃度的2～4 倍，抗菌素的亞抑制濃度能夠抑制聚苯乙烯微量滴定平板上生物膜的形成；在抑制生物膜的形成方面，酸性的香芹酚比中性的更有效[69]；含有香芹酚和肉桂醛的聚合物薄膜逐漸釋放出抗菌物質(zhì)，可能通過降低黏附能力和干擾鞭毛運動抑制葡萄球菌和大腸桿菌生物膜的形成[70]。Silva等[37]發(fā)現(xiàn)肉桂醛降低了鼠傷寒沙門氏菌生物膜的生物量和代謝活性，浮游細胞、生物膜細胞和肉桂醛處理的生物膜細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，與浮游細胞蛋白組相比，生物膜細胞中過氧化物酶、ATP合酶α亞基、共軛轉(zhuǎn)移切口酶/解旋酶TraI、延伸因子G表達上調(diào)，肉桂醛處理后，這些蛋白質(zhì)下調(diào)，說明肉桂醛通過干擾這些蛋白質(zhì)而影響鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成。Kim等[71]研究顯示，體積分數(shù)0.05%的肉桂精油和肉桂醛對銅綠假單胞菌生物膜的形成有明顯抑制作用，體積分數(shù)0.01%的肉桂精油、肉桂醛和丁香酚能顯著抑制出腸血性大腸桿菌O157:H7生物膜的形成；同時，肉桂精油顯著下調(diào)了腸血性大腸桿菌O157:H7生物膜形成相關(guān)基因csgAB的表達。

1.1 1 對群體感應(yīng)活性的影響

細菌通過稱為QS系統(tǒng)的細胞間通信系統(tǒng)，感知環(huán)境中低分子質(zhì)量、可擴散的信號分子來調(diào)控菌體密度，并在信號分子達到閾值時啟動相關(guān)基因表達，從而調(diào)控細菌的生理行為，以適應(yīng)環(huán)境的變化[72]。QS可以調(diào)節(jié)許多活動，如毒性因子表達、生物膜形成、胞外蛋白酶產(chǎn)生、DNA轉(zhuǎn)錄、生物發(fā)光、色素的生成、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移、群集運動、植物與微生物之間的交流和次生代謝物的產(chǎn)生等。QS基因的表達引起化學(xué)信號分子的產(chǎn)生，這些分子稱為自體誘導(dǎo)物（autoinducer，AI）或細菌信息素，當(dāng)細菌到達閾值濃度時，AI隨著細菌數(shù)量的增長而產(chǎn)生，導(dǎo)致特定基因的激活或抑制[73]。近年來，關(guān)于精油作為QS的無毒抑制劑的研究越來越廣泛[74]。?；呓z氨酸內(nèi)酯類（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）是革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)中最重要的一類AI信號分子，能夠調(diào)控許多生理特性的表達。綠薄荷精油對溫和氣單胞菌AHLs的分泌有抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，同時，綠薄荷精油通過干擾溫和氣單胞菌的QS系統(tǒng)，進而抑制生物膜的形成、胞外蛋白酶活力和細菌遷移（群集和泳動）[72]。陳建煙[75]從花葉艷山姜葉片中提取出精油，發(fā)現(xiàn)花葉艷山姜葉片精油抑制了黏質(zhì)沙雷氏菌和銅綠假單胞菌的QS活性，其進一步對精油中具有QS抑制活性的成分進行追蹤，結(jié)果顯示，該化合物為二氫-5,6-去氫卡瓦胡椒素。反式肉桂醛對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和化膿鏈球菌的QS均有抑制作用[15]。Yap等[30]利用兩株大腸桿菌生物傳感器，證實了肉桂精油可能具有抗QS作用，體積分數(shù)0.005%、0.0075%和0.01%的精油均抑制了分別攜帶lasR和luxR受體基因的大腸桿菌[pSB401]和[pSB1075]的生物發(fā)光。Myszka等[76]通過分析百里香精油、香芹酚和百里香酚對熒光假單胞菌KM121的AHLs、運動性、鞭毛基因（flgA）表達和生物膜形成能力的影響，發(fā)現(xiàn)百里香精油及其成分具有抗QS和抗生物膜的潛力。尋找靶向細菌QS的新化合物是開發(fā)新型抗生素的一個重要的策略，植物源抗生素通過抗QS系統(tǒng)，有效抑制細菌的致病性，且不會引起細菌耐藥性。

此外，精油及其成分對病原微生物細胞的抑制作用，還包括使細胞質(zhì)的凝固、對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和毒力的影響。Gustafson等[77]發(fā)現(xiàn)茶樹精油處理后，大腸桿菌細胞質(zhì)凝固，可能是蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致的。細菌中存在一種稱為雙元系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，研究表明，冷榨橘子精油能誘導(dǎo)耐藥金黃色葡萄球菌雙元系統(tǒng)相關(guān)基因vraS、vraR、arlS和arlR表達上調(diào)，vraSR雙元系統(tǒng)正向調(diào)控多個參與細胞壁合成的基因，arlSR雙元系統(tǒng)參與自溶速率和與聚合物附著有關(guān)的細胞壁活性，精油引起這些基因表達的上調(diào)，可能是由于細胞壁損傷誘導(dǎo)的保護反應(yīng)[18]。Amalaradjou等[60]研究顯示，反式肉桂醛使阪崎腸桿菌毒力因子相關(guān)基因的表達下調(diào)，這些毒力基因涉及阪崎腸桿菌多個重要生理行為，包括細菌運動性、宿主組織的黏附和侵襲、巨噬細胞的存活和脂多糖的合成。

2 結(jié) 語

精油作為一種具有廣譜抗菌活性的公認安全物質(zhì)，在食品領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值，精油及其成分的抗菌機理仍是未來的研究重點。研究精油及其成分之間的協(xié)同作用，既可以利用其抗菌活性，又可以在保證食品安全和健康的同時，降低達到特殊抗菌效果的精油使用濃度。此外，精油作為一種混合物，其抗菌效果難以量化，對抗菌機理的深入研究還有望建立精油及其成分和抗菌能力的關(guān)系。