動態(tài)高壓微射流處理對紅蕓豆多糖基本結構特征、流變性質(zhì)和固體形貌的影響

李安琪，黃曉君，聶少平，殷軍藝*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

動態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是一種新興的高壓均質(zhì)手段，廣泛應用于蛋白質(zhì)改性、微生物抑制、飲料均質(zhì)、碳水化合物改性[1-3]等方面。該技術利用高壓使物料在高速通過狹縫的過程中受到劇烈旋轉(zhuǎn)、高速剪切、高頻振蕩等綜合作用，實現(xiàn)物料的細化和均一化[4-5]，從而達到增加物料穩(wěn)定性的作用。已有研究表明，DHPM技術可有效提高大豆膳食纖維中可溶性膳食纖維的含量，降低不可溶性膳食纖維的含量，從而提高豆制品的穩(wěn)定性[6-7]。同時，有研究報道，DHPM技術會引起致敏性免疫球蛋白的構象變化和促進免疫球蛋白與多糖發(fā)生糖基化反應，從而降低致敏性免疫球蛋白的抗原性，進而降低免疫球蛋白的致敏性[8-9]。

蕓豆富含人體所需營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、酚類、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素等[10]，其中淀粉和非淀粉多糖的含量較高[11]。目前有關蕓豆化學成分的研究主要集中在淀粉、蛋白質(zhì)、植物凝集素、酶抑制劑、抗氧化劑、黃酮等化合物的結構與生物活性功能方面[12-15]；其中蕓豆多糖具有較強的降低餐后血糖水平的功效，搭配日常主食食用可以達到預防糖尿病的目的[16-17]?，F(xiàn)有的報道顯示，在化學結構方面，蕓豆中的非淀粉多糖主要為果膠成分，如Shiga等[18]從蕓豆子葉提取出果膠水溶性多糖，發(fā)現(xiàn)主要重復片段是木糖半乳糖醛酸聚糖型果膠，分支主要是由寡聚阿拉伯糖和短鏈半乳聚糖構成。

現(xiàn)代豆制飲品在加工過程中常利用均質(zhì)技術提高其穩(wěn)定性，但是部分研究顯示DHPM可以改變多糖的結構特性[19]，從而改變多糖的理化性質(zhì)。因此研究DHPM處理對蕓豆多糖的影響，對于將蕓豆應用于豆類飲料制品中具有潛在價值。本實驗針對紅蕓豆多糖（red kidney bean polysaccharide，RKBP）進行DHPM處理，分析其均質(zhì)前后的基本結構特征、流變性質(zhì)和固體形貌等變化，以期為今后相關產(chǎn)品開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅蕓豆產(chǎn)地為山西省朔州市朔城區(qū)，清洗種子表面的雜質(zhì)后自然干燥，密封保存。

單糖標準品（巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、鼠李糖（rhamnosus，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、果糖（fructose，F(xiàn)ru）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）） 美國Sigma公司；木糖（xylose，Xyl） 北京百靈威公司；葡聚糖標準品（T-10、T-40、T-50、T-70、T-500、T-2000） 美國Pharmacia公司；牛血清白蛋白 美國Amersco公司；考馬斯亮藍G-250 上海阿拉丁生化科技股份公司；濃硫酸、苯酚、3-苯基酚、四硼酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

M-7125-30型微射流均質(zhì)機 美國Microfluidics公司；E2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；Dionex ICS 5000離子交換色譜系統(tǒng)、Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；12 L立式冷凍干燥機 美國LABCONCO公司；T-9雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器公司；熱重（thermal gravimetric，TG）分析儀美國PE公司；ARES-G2流變儀 美國TA公司；JSM 6701F場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（配有能譜儀） 日本電子株式會社；AVIII 400 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 可溶性RKBP提取

紅蕓豆粉碎后過40 目篩，稱取一定量的蕓豆粉，以1∶5的料液比加入體積分數(shù)95%乙醇溶液浸泡24 h，揮干乙醇后，再以料液比1∶20加入蒸餾水，95 ℃攪拌4 h，過濾、去渣。提取液分別用α-淀粉酶（95 ℃、1 h）、蛋白酶（60 ℃、0.5 h）、糖化酶（60 ℃、0.5 h）酶解，100 ℃滅酶10 min，冰浴冷卻，離心（5 000 r/min，10 min）收集上清液。上清液濃縮至原體積的1/3，加入乙醇沉淀。離心收集沉淀，蒸餾水復溶后透析48 h，濃縮，冷凍干燥，得到可溶性RKBP。

1.3.2 DHPM處理RKBP

RKBP配制成20 mg/mL的溶液，磁力攪拌至充分溶解，分別使用40、80、120 MPa的壓力對多糖樣品進行均質(zhì)處理，每個壓力下均循環(huán)處理3 次，然后通過離心（10 000 r/min、4 ℃、15 min）去除沉淀，透析48 h，濃縮，冷凍干燥，收集均質(zhì)后多糖，不同壓力（40、80、120 MPa）處理樣品依次命名為：RKBP-40M、RKBP-80M、RKBP-120M。

1.3.3 基本理化性質(zhì)分析

以Glc為標準品，采用苯酚-硫酸法[20]測定中性糖質(zhì)量分數(shù)。以GlaA為標準品，采用間羥基聯(lián)苯法[21]測定糖醛酸質(zhì)量分數(shù)。采用考馬斯亮藍法測定多糖中的蛋白質(zhì)量分數(shù)[22]。

1.3.4 相對分子質(zhì)量測定

將多糖用流動相配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，用0.22 μm尼龍濾膜過濾進樣，采用高效體積排阻色譜法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）-多角度激光光散射（multiangle laser light scattering，MALLS）系統(tǒng)分析檢測。

HPSEC-MALLS系統(tǒng)參數(shù)：高效液相色譜泵（Model 1500）、保護柱P8514-000、串聯(lián)SB-804HQ和SB-806HQ色譜柱、檢測系統(tǒng)（MALLS檢測器、示差檢測器、黏度檢測器）。流動相：0.1 mol/L NaNO3（含有質(zhì)量分數(shù)0.02% NaN3），流速0.6 mL/min；進樣量為100 μL。利用ASTRA 6.1軟件采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 單糖組成分析

準確稱取5 mg樣品于厚壁耐壓瓶中，加入0.5 mL 12 mol/L硫酸在冰浴條件下磁力攪拌30 min，然后加入2.5 mL超純水，100 ℃條件下油浴攪拌反應2 h，充分冷卻，將樣品全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容并搖勻，再稀釋5 倍體積后過0.22 μm水系濾膜，采用離子交換色譜儀進樣分析[29]。

準確稱取5 mg Fuc、Rha、Ara、Glc、Gla、Man、Xyl、Fru、GlaA、GlcA標準品于50 mL容量瓶中，加入超純水溶解并定容搖勻，配制成單糖混標母液。將母液梯度稀釋為不同質(zhì)量濃度的混標溶液，過0.22 μm水系濾膜，采用離子交換色譜儀進樣分析。

檢測條件為保護柱：Dionex CarboPacTMPA20（30 mm×3 mm）；色譜柱：Dionex CarboPacTMPA20（150 mm×3 mm）；流動相：1 mol/L醋酸鈉、250 mmol/L氫氧化鈉、超純水。柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

單糖相對含量按下式計算。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品真空干燥12 h，取適量樣品和溴化鉀充分混勻、研磨，壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1區(qū)內(nèi)對樣品進行掃描分析。

1.3.7 熱穩(wěn)定性分析

稱取適量樣品放入TG分析儀，分析不同壓力處理多糖的熱穩(wěn)定性。測試條件：掃描溫度：30～700 ℃：升溫速率：10 ℃/min；N2流速：20 mL/min。

1.3.8 表觀黏度分析

將高壓微射流處理前后RKBP樣品配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的溶液，充分溶解，于25 ℃室溫靜置12 h，利用ARES-G2流變儀測定其表觀黏度（夾具直徑為40 mm，測定間隙為0.046 mm），測試溫度為25.0 ℃，剪切速率0.01～1 000 s-1，采用TA Orchestrator-7軟件采集數(shù)據(jù)。

1.3.9 SEM觀察

將高壓微射流處理前后RKBP樣品配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，充分溶解，于液氮中固定10 min，冷凍干燥，采用Model IB-3離子鍍膜機進行噴金處理，于SEM下觀察，通過XT Microscope Control軟件采集圖譜。

1.3.10 NMR分析

稱取高壓微射流處理前后RKBP樣品50 mg，溶于12 mL重水，冷凍干燥，重復3 次。經(jīng)重水交換后的樣品溶于0.55 mL重水，充分溶解，室溫靜置12 h后，進行NMR測試，得到1H NMR圖譜，所有樣品均在293 K條件下測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

樣品進行3 次平行實驗，結果用平均值±標準偏差表示。采用SPSS軟件進行統(tǒng)計，對不同均質(zhì)壓力處理的樣本進行單因素方差分析，采用Tukey法進行兩兩比較，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 DHPM處理對RKBP基本理化性質(zhì)的影響

表1為DHPM處理對RKBP基本理化性質(zhì)影響的測定結果。經(jīng)DHPM處理后的樣品中性糖質(zhì)量分數(shù)、糖醛酸質(zhì)量分數(shù)顯著提高，樣品中的蛋白質(zhì)量分數(shù)呈一定的下降趨勢，由1.82%最低下降至1.03%，已有研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)過高壓均質(zhì)作用后，其分子粒徑減小，暴露出更多的帶電基團，分子間靜電排斥力增強，進而導致其親水性、流動性增加[23]。因此結合樣品制備過程分析，可能是蛋白質(zhì)經(jīng)DHPM處理后粒徑減小、溶解性增強，在樣品制備后期的透析過程中流失；因此，樣品中的蛋白質(zhì)量分數(shù)有所降低。上述結果顯示，經(jīng)過高壓微射流均質(zhì)處理后，樣品的糖含量有一定提升。在不同壓力處理下，樣品得率為68%～81%，這可能是樣品進入均質(zhì)機前的適當潤洗、少量樣品均質(zhì)時在儀器中的殘留，以及均質(zhì)后樣品離心時損失了少量不溶物造成的[24]。

表1 DHPM處理前后RKBP的基本理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of RKBP before and after DHPM treatment

2.2 DHPM處理對RKBP表觀黏度的影響

從圖1可知，隨著剪切速率的增加，樣品的表觀黏度呈下降趨勢，說明樣品屬于典型的非牛頓流體。這可能是由于多糖在DHPM處理過程中，由于高剪切力和湍流力造成了有序或無序的構象轉(zhuǎn)變以及多糖分子鏈的斷裂，致使其黏度降低[25]。也有研究表明，微射流造成樣品黏度下降可能是因為多糖這類聚合物在高剪切力和湍流力作用下相對分子質(zhì)量被平均化[26]。剪切速率較低時，RKBP-40M、RKBP-80M的表觀黏度和RKBP差異不明顯，而RKBP-120M的黏度明顯小于另外3 個樣品。隨剪切速率的增加，DHPM處理后的樣品表觀黏度下降趨勢更大，剪切稀化的效果更加明顯。綜上可知，DHPM處理可以有效地降低RKBP的表觀黏度，增加固形物的沉降率，離心處理后有利于除去固形物，從而增加溶液穩(wěn)定性[27]。

圖1 DHPM處理前后RKBP表觀黏度隨剪切速率變化情況Fig. 1 Changes in apparent viscosity of RKBP with high shearing rate before and after DHPM treatment

2.3 DHPM處理對RKBP相對分子質(zhì)量、特性黏度等指標的影響

圖2 DHPM處理前后RKBP的HPSEC示差檢測色譜圖Fig. 2 HPSEC chromatogram with differential detection of RKBPbefore and after DHPM treatment

圖2 為RKBP的示差檢測器信號，其相對分子質(zhì)量分布較寬，主要含有峰1和峰3這兩個組分，此外還含有少量的峰2組分。經(jīng)過DHPM處理后，峰1組分對應的洗脫時間逐漸后移，表明多糖的相對分子質(zhì)量下降，隨著處理壓力增加，峰1組分相對分子質(zhì)量下降更加明顯，但是對峰2和峰3組分的相對分子質(zhì)量影響相對較小。

表2 HPSEC-MALLS測定DHPM處理前后RKBP的分子參數(shù)Table 2 Molecular parameters of RKBP before and after DHPM treatment estimated by high performance size exclusion chromatography-multiangle laser light scattering analysis

由于峰3組分相對分子質(zhì)量較小，因此主要對峰1和峰2兩個組分的相對分子質(zhì)量等參數(shù)進行了分析。DHPM處理前后樣品峰1的變化主要表現(xiàn)在兩個方面：示差出峰信號變化和峰寬變化。峰1示差出峰信號明顯向后推移，說明峰1相對分子質(zhì)量顯著下降，由表2可知，DHPM處理壓力越大，DHPM的峰1相對分子質(zhì)量越小，同時峰1的特性黏度也下降，這與樣品的表觀黏度下降現(xiàn)象相一致。峰2組分的相對分子質(zhì)量等指標也有一定下降。綜上表明，DHPM處理能降低RKBP的相對分子質(zhì)量。

2.4 DHPM處理對RKBP單糖組成的影響

表3 DHPM處理前后RKBP的單糖組成及其相對含量變化Table 3 Monosaccharide composition of RKBP before and after DHPM treatment

由表3可知，RKBP主要含有Rha、Ara、Xyl、GalA和Gal，表明RKBP屬于果膠類多糖[28]。原樣的Gal相對含量與DHPM處理后的樣品存在顯著性差異，且不同壓力處理的樣品之間也差異顯著，Gal相對含量由1.55%隨處理壓力增加依次上升至8.25%、6.95%、8.60%，變化幅度較大；Glc相對含量與DHPM處理后的樣品也由5.65%顯著下降至1.25%、0.45%、1.45%；此外，GalA、Ara的相對含量也均隨DHPM壓力的升高而顯著增加，但不同壓力處理的樣品之間差異不顯著。

結合文獻分析造成單糖組成變化的原因，可能是由于：1）經(jīng)DHPM處理后再離心可以除去少量沉淀物質(zhì)，使得均質(zhì)后的多糖純度在一定程度上有所提升，導致一部分單糖含量有所提升；2）經(jīng)DHPM處理后，多糖糖鏈上斷裂的單糖（尤其是側鏈和末端殘基）在透析過程中流失，造成部分單糖測定結果下降[29]。此外，DHPM過程導致多糖大分子鏈斷裂（相對分子質(zhì)量降低），在相同水解條件下，經(jīng)DHPM處理后得到的多糖水解效率更高，因此總糖含量也更高。

2.5 DHPM處理對RKBP傅里葉變換紅外光譜的影響

圖3 DHPM處理前后RKBP傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transfer infrared spectra of RKBP before and after DHPM treatment

由圖3可知，3 413.5 cm-1附近的吸收峰為O—H伸縮振動，2 927.6 cm-1附近的吸收峰為C—H伸縮振動，1 200～1 414 cm-1附近的吸收峰為C—H彎曲振動，這3 個峰是糖類特征吸收峰，由此推斷RKBP是糖類化合物。1 650.1 cm-1附近的強吸收峰為羧基特征吸收峰，證明RKBP是酸性多糖，1 046.9 cm-1附近的吸收峰證明存在C—O—C[30]。DHPM處理前后多糖的傅里葉變換紅外光譜差異不明顯，說明DHPM對RKBP的官能團影響較小。

2.6 DHPM處理對RKBP固體形貌的影響

圖4 DHPM處理前后RKBP的SEM圖（1 000×）Fig. 4 Scanning electron microscopic images of RKBP before and after DHPM treatment (1 000 ×)

從圖4可以看出，RKBP最顯著的特征是表面形貌起伏不平，鏈結構邊緣有球狀物，無規(guī)則地卷曲排布，空間間隙較大。RKBP-40M的絲狀結構比RKBP的絲狀結構更細，高壓下（80、120 MPa）處理得到的RKBP-80M和RKBP-120M，多糖鏈出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，鏈邊緣的球狀結構數(shù)量增加，空間間隙變小，且RKBP-120M的團聚現(xiàn)象比RKBP更為嚴重。上述結果表明，DHPM處理對RKBP的固體形貌有一定影響。

2.7 DHPM處理對RKBP的1H NMR譜圖特征的影響

由圖5可知，雖然前期利用較多經(jīng)典的多糖提取和分離純化手段處理，但所得樣品的結構仍比較復雜，在δ 0.96～2.73分布了較多非碳水化合物的信號峰，這些信號可能來自于氨基酸，這與理化性質(zhì)分析中檢測到的蛋白質(zhì)結果相印證。在δ 3.75的一個非常強的信號峰代表羧基上的甲基，結合單糖組成分析證明GalA的存在[31]。在δ 2.06附近的一個較強的信號峰是GalA乙酰化的結果[32]。在δ 1.20、1.28的信號峰證明了Rha的存在[33]，這與單糖組成的結果一致。對比高壓微射流前后樣品的異頭氫區(qū)域（δ 4.5～5.5）信號峰，發(fā)現(xiàn)DHPM處理后RKBP的1H NMR譜峰型沒有明顯的變化。

圖5 DHPM前后RKBP的1H NMR譜圖（293 K）Fig. 5 1H nuclear magnetic resonance spectra of RKBP before and after DHPM treatment (293 K)

2.8 DHPM處理對RKBP熱穩(wěn)定性的影響

圖6 DHPM處理前后RKBP的TG圖Fig. 6 Thermogravimetric plots of RKBP before and after DHPM treatment

圖6 是DHPM前后RKBP的TG曲線測定結果，對RKBP熱降解而言，結合參考文獻[34]分析，主要存在4 個階段：第1階段是失水階段（30～110 ℃），該階段主要是隨溫度升高，水分變?yōu)闅鈶B(tài)被保護氣帶走而造成的質(zhì)量損失；第2階段是熱解準備階段（110～240 ℃），該階段質(zhì)量幾乎不變，主要發(fā)生多糖的解聚；第3階段是熱解質(zhì)量損失階段（240～400 ℃），在這個階段多糖、淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生軟化和分解，大部分物質(zhì)生成揮發(fā)性物質(zhì)，導致質(zhì)量大幅下降，部分物質(zhì)炭化，質(zhì)量損失約為50%；第4階段為炭化階段（400～700 ℃），該階段主要是殘留物的緩慢分解，質(zhì)量損失速率較為平緩，質(zhì)量損失約為13%，主要發(fā)生物質(zhì)的炭化和聚合，最終生成焦炭被剩下，生成的氣體被保護氣帶走。

經(jīng)過DHPM處理后所得各種多糖的TG圖與RKBP相似，表明DHPM處理對RKBP的熱穩(wěn)定性影響不明顯。

3 結 論

以RKBP為研究對象，采用DHPM的不同壓力對其進行加工處理，探究DHPM對RKBP基本結構特征、流變性質(zhì)和固體形貌等指標的影響。RKBP經(jīng)過DHPM處理后得率降低，總糖質(zhì)量分數(shù)隨壓力的增加而升高，多糖質(zhì)量分數(shù)有所提高，單糖組成出現(xiàn)差異；RKBP的表觀黏度、相對分子質(zhì)量（主要是影響高分子質(zhì)量組分峰1）隨處理壓力的增大而減??；SEM觀察結果說明隨著壓力升高，多糖固體形貌變化愈加明顯。由傅里葉變換紅外光譜結果可知，DHPM處理未對多糖官能團特征峰產(chǎn)生明顯的影響；RKBP的TG分析結果顯示均質(zhì)前后樣品無明顯差異，說明化學成分沒有明顯變化。1H NMR譜圖表明DHPM前后樣品的總體峰型無明顯區(qū)別。因此，結合DHPM技術將蕓豆應用于飲料工業(yè)中可增加飲料穩(wěn)定性且不破壞蕓豆多糖的化學結構，可行性較高，具有一定的研究意義。