纖維素/海藻酸鈉復(fù)合氣凝膠的表面功能化與仿生礦化

査 莉， 王璐瑤， 鄭雅慧， 車劍飛

（南京理工大學(xué)化工學(xué)院，南京 210094）

骨修復(fù)材料的多孔結(jié)構(gòu)對(duì)其生物活性具有重要意義，它不僅能為骨細(xì)胞和纖維細(xì)胞提供生長(zhǎng)空間和通道，以便血管長(zhǎng)入；而且可以使長(zhǎng)入組織形成機(jī)械卯合，增強(qiáng)彼此的結(jié)合[1,2]。纖維素水凝膠兼具生物降解性和生物相容性。采用冷凍干燥或超臨界干燥方法[3-5]，可以得到用氣體代替凝膠內(nèi)部液體而不發(fā)生孔洞坍塌的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)氣凝膠，其理想的多孔結(jié)構(gòu)支架使其廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域。以纖維素氣凝膠為支架，在其表面沉積羥基磷灰石（HA），已經(jīng)成為骨組織工程材料研究和應(yīng)用領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)[6]。各種支架表面官能團(tuán)誘導(dǎo)磷灰石的生長(zhǎng)能力依次為PO4H2＞COOH＞＞CONH2/OH＞NH2＞＞CH3[7]。纖維素氣凝膠表面的HA 成核能力較弱，反應(yīng)活性不佳，所以需要通過接枝各種官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)改性增強(qiáng)其礦化能力。為了使HA 更好地沉淀在纖維素支架上，F(xiàn)avi 等[8]使用激光圖案化技術(shù)制備了蜂窩狀細(xì)菌纖維素支架，并采用高碘酸鹽氧化法對(duì)細(xì)菌纖維素支架進(jìn)行了改性。Safwat 等[9]用2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-氧基自由基（TEMPO）/NaBr/NaClO 選擇性氧化體系氧化納米纖維素，通過摻入雙相磷酸鈣進(jìn)行礦化得到骨修復(fù)材料。

海藻酸鈉（SA）具有較強(qiáng)的親水性，將它與纖維素（Cellu）混合，可利用兩者親水性差異制備大孔材料[10]。本文以Cellu/SA 復(fù)合氣凝膠作為支架模板，在進(jìn)一步對(duì)Cellu/SA 復(fù)合氣凝膠以高碘酸鈉和亞氯酸鈉進(jìn)行2 次氧化后，制得的羧基化纖維素/海藻酸鈉（COOH-Cellu/SA）復(fù)合氣凝膠具有更大的比表面積、更豐富的表面羧基基團(tuán)。與改性前相比，改性復(fù)合氣凝膠的生物礦化效率明顯提高，并且無毒性，能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

纖維素、海藻酸鈉：北京百靈威科技有限公司；NaIO4：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；CH3COOH、NaClO2、NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、CaCl2、Na2SO4、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、尿素（Urea）、環(huán)氧氯丙烷（ECH）、乙二醇：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去離子水：實(shí)驗(yàn)室制備；鹽酸：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 測(cè)試與表征

采用日本島津公司FTIR-8400S 型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，測(cè)量范圍為4 000～400 cm-1；采用日本電子株式會(huì)社JSM-7600F 型超高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（SEM）對(duì)氣凝膠進(jìn)行觀測(cè)；采用德國(guó)BRUKER 公司D8 ADVANCE 型X 射線衍射儀（XRD），使用Cu 靶，在電壓為40 kV、電流為40 mA、衍射范圍2θ 為10°～70°的條件下對(duì)礦化氣凝膠進(jìn)行XRD 測(cè)試；采用日本納米表面分析儀器公司PHI5300 型X射線光電子能譜儀（XPS），以Al Kα 單色射線為激發(fā)源（能量分辨率小于0.6 eV）對(duì)礦化氣凝膠進(jìn)行測(cè)試；采用杜爾料改良伊格爾（DMEM）高糖培養(yǎng)基在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠成纖維（L929）細(xì)胞，并在一定條件下加入氣凝膠浸提液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒測(cè)定（CCK8）法進(jìn)行細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，并用活/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)（Live/Dead）的雙染試劑在24、48、72 h 對(duì)細(xì)胞染色，采用日本尼康Ti2-E 型倒置熒光顯微鏡觀察L929 細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及活性。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 化學(xué)氧化法制備COOH-Cellu/SA 氣凝膠[10,11]配制NaOH-尿素-水（質(zhì)量比為7∶12∶81）的混合堿溶液97 g，置于-18 ℃條件下預(yù)冷過夜。稱取3 g 纖維素粉加入前述97 g 混合堿溶液中進(jìn)行攪拌，直至溶液透明。另外再稱取3 g 海藻酸鈉粉加入97 g 常溫堿溶液中攪拌，得到w=3%的海藻酸鈉溶液。

首先在纖維素-海藻酸鈉（質(zhì)量比為7/3，總計(jì)10 g）混合溶液中加入1 mL 交聯(lián)劑ECH，在室溫下攪拌1 h，直至油滴狀的ECH 完全消失；然后將其置于60 ℃烘箱中3 h 形成水凝膠，并在去離子水中熟化去除雜質(zhì)；最后進(jìn)行冷凍干燥，得到Cellu/SA 氣凝膠。將0.15 g Cellu/SA 加入含0.3 g NaIO4的100 mL 蒸餾水中，25 ℃條件下避光攪拌48 h，然后添加過量的乙二醇，繼續(xù)攪拌2 h，除去多余的NaIO4，用去離子水洗凈，真空冷凍干燥72 h，得到醛基化復(fù)合氣凝膠（CHO-Cellu/SA）。

將0.15 g CHO-Cellu/SA 浸入含有0.3 g NaClO2的CH3COOH 溶液中（100 mL，2 mol/L），并在25 ℃下攪拌72 h，得到COOH-Cellu/SA 氣凝膠。

1.3.2 COOH-Cellu/SA 的礦化 礦化溶液的配制[12]步驟如下：在36.5 ℃恒溫下，向1 000 mL 的塑料燒杯中依次加入NaCl（11.994 g），NaHCO3（0.525 g），KCl（0.336 g），K2HPO4·3H2O（0.342 g），MgCl2·6H2O（0.458 g），1.0 mol/L 的鹽酸（60 mL），CaCl2（0.417 g），Na2SO4（0.107 g），Tris（9.086 g）并不斷攪拌，保持pH 為7.42～7.45，直至Tris 加完。最終緩慢滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.40，即得到礦化溶液。該過程中不斷攪拌，保持溶液恒溫36.5 ℃，并清澈透明。將配好的礦化溶液移入1 000 mL 容量瓶定容，再轉(zhuǎn)移至塑料燒杯中用塑料薄膜密封，冷藏備用。

將Cellu/SA、COOH-Cellu/SA 浸泡在0.1 mol/L 的CaCl2溶液中3 d 進(jìn)行預(yù)礦化。每天更換CaCl2溶液。預(yù)礦化結(jié)束后，用去離子水輕輕沖洗再放入50 mL 的離心管中，加入礦化溶液，并在36.5 ℃恒溫水浴鍋中分別礦化3、5、7 d。礦化溶液每天更換1 次，礦化后的產(chǎn)物標(biāo)記為Cellu/SA-Ca3D（5D、7D）、COOH-Cellu/SACa3D（5D、7D）。

2 結(jié)果與討論

2.1 COOH-Cellu/SA 的合成

纖維素氣凝膠表面的羥基誘導(dǎo)HA 的成核能力較弱，海藻酸鈉的加入可以引入部分羧基，但難以滿足高效礦化的要求。本文采用高碘酸鈉和亞氯酸鈉的2 次氧化法，在復(fù)合氣凝膠表面引入羧基以增強(qiáng)其礦化能力，具體反應(yīng)原理如圖1 所示。在NaIO4的作用下，復(fù)合氣凝膠中的纖維素和海藻酸鈉的順二醇C2 和C3 位置上的羥基發(fā)生斷裂，與形成張力較小的環(huán)狀絡(luò)化物，最終得到含有醛基的CHO-Cellu/SA。再用NaClO2在醋酸的作用下對(duì)CHO-Cellu/SA 的醛基進(jìn)行進(jìn)一步氧化，最終醛基被進(jìn)一步氧化為羧基[11,13]。

圖1 2 次氧化Cellu/SA 復(fù)合氣凝膠的機(jī)理Fig. 1 Mechanism of secondary oxidation modification of Cellu/SA composite aerogels

2.2 COOH-Cellu/SA 的XPS 分析

復(fù)合氣凝膠中C1s 峰在氧化前后的高分辨率XPS 譜如圖2 所示。C1s 結(jié)合能取決于碳和其他元素之間的鍵合情況。就C1s 峰而言，Cellu/SA 里通常包含了C―OH/C―C、C―O、C―O―C 和―COOR，結(jié)合能分別為284.5、286.5、287.8、288.9 eV[14]。經(jīng)過氧化后，C―O 峰的強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。相反，―COOR 峰的強(qiáng)度有增加的趨勢(shì)。這表明，纖維素和海藻酸鈉表面C2 和C3 位置的C―OH 被氧化為―COOH。表1 總結(jié)了氧化前后的復(fù)合氣凝膠中C 基的峰面積和相對(duì)原子百分比。根據(jù)相應(yīng)峰的高斯/洛倫茲擬合計(jì)算C 基的相對(duì)原子百分比可以看出，C―O、O―C―O 含量呈下降趨勢(shì)，C―H/ C―C、―COOR 含量呈上升趨勢(shì)。復(fù)合氣凝膠經(jīng)過改性后，―COOR 的峰面積由未改性復(fù)合氣凝膠的3.83%增加到改性后的4.76%。但值得注意的是，過度的氧化會(huì)導(dǎo)致氣凝膠結(jié)構(gòu)破壞。

圖2 Cellu/SA（a）和COOH-Cellu/SA（b）的C1s 峰高分辨XPS 能譜Fig. 2 High-resolution XPS spectra of C1s peaks in original composite aerogels （a） and dicarboxylic composite aerogel （b）

表1 Cellu/SA 和COOH-Cellu/SA 中C 基的峰面積和相對(duì)原子百分比Table 1 Peak areas and relative atomic percentage of C moieties in Cellu/SA and COOH-Cellu/SA

2.3 COOH-Cellu/SA 礦化的FT-IR 分析

氣凝膠羧基化改性前后及其仿生礦化的紅外譜圖如圖3 所示。CHO-Cellu/SA 氣凝膠在1 730 cm-1處出現(xiàn)了醛基的―C=O 振動(dòng)吸收峰，表明氣凝膠表面被有效氧化[15]。COOH-Cellu/SA 氣凝膠的―C=O 振動(dòng)吸收峰明顯增強(qiáng)，并向高波數(shù)移動(dòng)（1 730 cm-1），表明氣凝膠表面的醛基被氧化成羧基。但由于纖維素氧化后形成的羧基位置相鄰，容易形成二締合體，彼此間受到氫鍵的影響，與獨(dú)立的羧基相比（1 770～1 750 cm-1），新出現(xiàn)的羧基吸收峰位置向低波數(shù)位移（1 735 cm-1）[16]。羧基化改性前后的氣凝膠樣品的紅外光譜，在仿生礦化后都明顯出現(xiàn)了HA 的磷酸鹽特征峰（其中，550 cm-1和610 cm-1歸屬于O―P―O 的彎曲振動(dòng)，930 cm-1歸屬于C―O―P 的拉伸振動(dòng)）[17-19]。但相比于未改性的氣凝膠樣品，

圖3 Cellu/SA 和COOH-Cellu/SA 仿生礦化的FT-IR 譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of biomineralized original composite aerogels and dicarboxylic composite aerogel

2.4 COOH-Cellu/SA 的生物礦化行為

圖4 為復(fù)合氣凝膠經(jīng)過不同時(shí)間礦化后的XRD 圖譜。通常纖維素Ⅰ和海藻酸鈉分別在14.5°、15.9°、20.5°、22.7°、34.6°和14.0°、23.0°有衍射峰，然而在復(fù)合氣凝膠的XRD 圖譜并中沒有觀察到相應(yīng)的衍射峰，這可能是由于凝膠形成過程中，交聯(lián)劑在纖維素和海藻酸鈉之間形成了有效化學(xué)交聯(lián)，保證了兩者的均勻混合，阻止了纖維素和海藻酸鈉各自的結(jié)晶行為，從而形成了非晶態(tài)復(fù)合氣凝膠[10]。羧基化改性前后的樣品，仿生礦化后均在31.9°和45.0°處出現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于HA 的晶體平面（211）和（222）特征峰[20]。但與未改性復(fù)合氣凝膠的礦化樣品相比，羧基化復(fù)合氣凝膠在同樣礦化3 d 后表面已經(jīng)能觀察到HA 晶體的特征峰，且7 d 后的HA 晶體特征峰更加尖銳。這意味著羧基化復(fù)合氣凝膠表面HA 晶體的沉積速率更快。這是因?yàn)轸然瘡?fù)合氣凝膠表面的羧基含量更豐富，電負(fù)性更強(qiáng)，可以提供更多的配合位點(diǎn)與 Ca2+絡(luò)合。

圖4 礦化氣凝膠的XRD 譜圖Fig. 4 XRD pattern of the mineralized aerogels

2.5 COOH-Cellu/SA 礦化的形貌和XPS 分析

圖5 所示為氣凝膠經(jīng)過仿生礦化7 d 后樣品表面Ca-P 礦化物的SEM 形貌以及其XPS 圖譜。圖5（a）為Cellu/SA-Ca7D 一個(gè)代表孔洞的低放大倍率SEM 照片，可以觀察到其大孔套小孔，平均孔徑為500 μm，有利于成骨細(xì)胞的附著及礦化物質(zhì)的傳遞[21]。經(jīng)放大后的SEM 照片（圖5（b，c））顯示，在礦化溶液中浸泡7 d 后，在改性前后的兩種氣凝膠表面均清晰地觀察到顆粒沉積。這是由于氣凝膠的表面官能團(tuán)如―OH 和―COOH 都具有結(jié)合 Ca2+形成原子核的能力，可以誘導(dǎo)Ca2+吸附在氣凝膠表面。

與未改性樣品（圖5（b））相比，羧基化復(fù)合氣凝膠（圖5（c））表面沉積的磷灰石納米粒子的晶粒尺寸更小、沉積層更均勻。這是因?yàn)轸然瘡?fù)合氣凝膠表面的羧基含量更豐富，電負(fù)性更強(qiáng)，可以提供更多的配合位點(diǎn)與 Ca2+絡(luò)合，從而使磷灰石的成核速率更高，有更多的晶核來誘導(dǎo)HA 生長(zhǎng)[22]。該結(jié)果與圖5（d，e）顯示的礦化復(fù)合氣凝膠的XPS 結(jié)果相符。

如圖5（d）所示，氣凝膠圖譜上可識(shí)別出碳（C1s）、氧（O1s）、鈣（Ca2p）和磷（P2p）的特征峰，這表明有HA沉積在COOH-Cellu/SA-Ca7D 上。COOH-Cellu/SA 氣凝膠中n（Ca）∶n（P）=1.35，接近HA 的理論值（1.67）[23]。對(duì)比兩者的高分辨XPS 譜圖（圖5（e））的Ca2p 和P2p 特征峰，未改性的礦化復(fù)合氣凝膠的鈣（Ca2p）和磷（P2p）的特征峰強(qiáng)度較弱，難以觀察到。COOH-Cellu/SA 氣凝膠礦化后的Ca2p 和P2p 特征峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于未改性礦化氣凝膠的。

2.6 礦化復(fù)合氣凝膠支架的體外細(xì)胞毒性

Live/Dead 染色結(jié)果如圖6（a，b，c）所示?？偟膩碚f，所有實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度相近，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，具有良好的活性，其形態(tài)清晰且死細(xì)胞較少。在培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞正常生長(zhǎng)，活細(xì)胞被染色成亮綠色，紅斑表明出現(xiàn)罕見的死亡細(xì)胞。隨著時(shí)間增加到48 h，細(xì)胞增殖導(dǎo)致明顯的綠色斑點(diǎn)出現(xiàn)，表明細(xì)胞發(fā)生了進(jìn)一步生長(zhǎng)與分化。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至72 h 時(shí)，礦化后的復(fù)合氣凝膠和羧基化復(fù)合氣凝膠浸提液的綠色熒光強(qiáng)度顯著提高，表明活細(xì)胞的數(shù)目更多，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。

圖5 Cellu/SA-Ca7D（a，b）、COOH-Cellu/SA-Ca7D（c）的SEM 圖片以及其XPS 譜圖（d、e）Fig. 5 SEM images of Cellu/SA-Ca7D（a, b）, COOH-Cellu/SA-Ca7D（c）, survey scan （low resolution） of XPS patterns（d） and its high resolution scan（Ca2p and P2p）（e） of COOH-Cellu/SA-Ca7D and Cellu/SA-Ca7D

此外，如圖6（d）所示，COOH-Cellu/SA-Ca7D 和Cellu/SA-Ca7D 的L929 細(xì)胞活性均在80% 以上。根據(jù)ISO 10993-5 中體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[24]可知，它們的細(xì)胞毒性均為1 級(jí)，符合無毒標(biāo)準(zhǔn)。這表明它們的體外細(xì)胞毒性較低，而且化學(xué)改性對(duì)其體外細(xì)胞毒性影響不大[24]。

圖6 L929 細(xì)胞加入浸提液培養(yǎng)不同時(shí)間Live/Dead 的熒光顯微鏡圖（a，b，c）以及CCK8 毒性測(cè)試（d）Fig. 6 Representative Live/Dead fluorescence images of L929 cells cultured with extracts solution （a，b，c） and cell cytotoxicity （d）

3 結(jié) 論

（1）采用NaIO4和NaClO2對(duì)Cellu/SA 復(fù)合氣凝膠2 次氧化后，成功將氣凝膠表面的羥基氧化為羧基，得到富含羧基的表面活性氣凝膠COOH-Cellu/SA。

（2）與未改性復(fù)合氣凝膠相比，羧基化復(fù)合氣凝膠表面沉積的磷灰石納米粒子更多，n（Ca）∶n（P）=1.35。其晶粒尺寸相對(duì)較小、沉積層更均勻。

（3）改性前后的復(fù)合氣凝膠都具有良好的體外細(xì)胞毒性，而且化學(xué)改性對(duì)其體外細(xì)胞毒性影響不大。

（4）礦化后的復(fù)合氣凝膠能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞活性，是一種理想的骨組織工程材料。