高分子量外消旋聚乳酸的合成、表征及工藝優(yōu)化

王雅琪， 楊 洋， 王柳迪， 李玉林， 劉昌勝

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

近年來(lái)，自然災(zāi)害、交通事故、工業(yè)污染及人口老齡化等原因造成的骨組織缺損和損傷已成為日益困擾和影響人類健康的一項(xiàng)重要醫(yī)學(xué)課題[1]。傳統(tǒng)的金屬骨修復(fù)材料具有較高的力學(xué)性能，已被用來(lái)制作內(nèi)固定器械，然而金屬材料的模量遠(yuǎn)高于骨組織的模量，這往往引起應(yīng)力遮擋效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致并發(fā)癥的產(chǎn)生[2]；同時(shí)大多數(shù)金屬材料在使用過程中易釋放出毒性金屬離子，對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。此外，醫(yī)用金屬材料普遍缺乏生物降解性能，常常需要二次手術(shù)取出[3]。因此，現(xiàn)在多將可降解的高分子材料用于骨修復(fù)，其中聚乳酸（PLA）作為一種生物基可降解聚合物[4,5]，具有良好的生物相容性[6]和生物可吸收性[7]，在體內(nèi)的降解可通過高分子鏈中酯鍵的水解斷裂實(shí)現(xiàn)，其降解產(chǎn)物乳酸為人體正常代謝產(chǎn)物，因此對(duì)人體無(wú)毒副作用[8]，已被廣泛用于臨床和醫(yī)藥領(lǐng)域，其應(yīng)用主要包括藥物輸送[9]、手術(shù)縫合線[10]、骨固定材料[11]、防黏連膜[12]和可吸收骨修復(fù)支架等[13]。然而，臨床使用的PLA 由于分子量較低，力學(xué)強(qiáng)度較差，限制了它在組織修復(fù)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用，因此需要開發(fā)高分子量PLA 的合成技術(shù)。

現(xiàn)有的PLA 合成路線包括乳酸直接縮合聚合、丙交酯開環(huán)聚合（ROP）和乳酸共沸脫水縮合聚合3 種制備方法[14]。乳酸直接縮合聚合是由乳酸經(jīng)本體縮合聚合反應(yīng)生成聚乳酸的方法，但乳酸縮合聚合過程中會(huì)生成水，而水的存在不利于反應(yīng)正向進(jìn)行，因此所得到的產(chǎn)物分子鏈較短[15]。乳酸共沸脫水縮合聚合是將乳酸和催化劑在減壓條件下于回流的高沸點(diǎn)非質(zhì)子溶劑中共沸脫水以制備分子量較高的PLA 的一種方法，但該反應(yīng)條件苛刻，生產(chǎn)成本高且工藝復(fù)雜[16,17]。與前面兩種合成方法相比，ROP 反應(yīng)過程中沒有副產(chǎn)物產(chǎn)生，可以獲得分子量較高的PLA[18]；但該反應(yīng)需要在無(wú)水、無(wú)氧條件下進(jìn)行，這一嚴(yán)苛條件增加了反應(yīng)設(shè)備的設(shè)計(jì)難度，使得高分子量PLA 的大規(guī)?？煽刂苽浼夹g(shù)難以實(shí)現(xiàn)，限制了我國(guó)PLA 產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。此外，傳統(tǒng)的丙交酯開環(huán)聚合反應(yīng)通常要使用有機(jī)溶劑如甲苯[19,20]，不僅增加了成本，而且有毒副作用。

鑒于此，本研究報(bào)道了一種綠色環(huán)保的丙交酯開環(huán)聚合技術(shù)，反應(yīng)過程中不引入任何有機(jī)溶劑，在無(wú)水、無(wú)氧操作系統(tǒng)及熔融狀態(tài)下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)規(guī)模易于放大。通過研究丙交酯開環(huán)聚合影響因素（反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、催化劑與單體的物質(zhì)的量之比）對(duì)所制備外消旋聚乳酸（PDLLA）分子量的作用規(guī)律，并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化開環(huán)聚合反應(yīng)條件，制備了高分子量PDLLA，并對(duì)其力學(xué)性能、降解性能及生物相容性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

外消旋-丙交酯（D, L-LA）：分析純，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司；辛酸亞錫（Sn（Oct）2）：分析純，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；二氯甲烷：分析純、上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；超純水：華東理工大學(xué)生物材料所。

1.2 測(cè)試與表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司Nicolet 6700 型）測(cè)定聚合物的紅外光譜，將聚合物在液氮中冷凍后置于粉碎機(jī)粉碎為粉末，取適量粉末與KBr 充分混合研磨后采取壓片制樣，掃描范圍4 000～500 cm-1；采用凝膠滲透色譜（GPC）儀（美國(guó)WATERS 公司W(wǎng)aters1515 型）測(cè)定聚合物的數(shù)均分子量，流動(dòng)相為四氫呋喃（THF），流速1 mL/min，測(cè)試溫度35 ℃，標(biāo)樣為聚苯乙烯（PS）；采用差示掃描量熱儀（TA 儀器公司DSC 2910 型）測(cè)定聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，從25 ℃以10 ℃/min 的速率升溫至120 ℃（一次升溫），保持1 min；以10 ℃/min 的速率從120 ℃降至-20 ℃，保持5 min；以10 ℃/min 的速率由-20 ℃升溫至120 ℃（二次升溫）后結(jié)束測(cè)試；采用核磁共振儀（德國(guó)BRUKER 公司AVANCE-III 型，400 MHz）分析聚合物的結(jié)構(gòu)，氘代氯仿（CD3Cl）為溶劑；采用綜合熱分析儀（德國(guó)NETZSCH 公司STA409PC 型）測(cè)定聚合物的分解溫度，使用真空干燥的聚合物樣品，升溫區(qū)間為25～600 ℃，氮?dú)夥諊?，升溫速率?0 ℃/min。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 PDLLA 的制備 實(shí)驗(yàn)在無(wú)水、無(wú)氧條件下進(jìn)行。在手套箱稱取一定質(zhì)量的D, L-LA 于三口燒瓶，加入適量催化劑Sn（Oct）2，反應(yīng)容器在真空條件下于室溫預(yù)干燥1 h 后，通入氬氣，然后快速升溫至130～170 ℃的某一溫度，在該溫度反應(yīng)一段時(shí)間，全程保證裝置處于氬氣氛圍。反應(yīng)結(jié)束后，先停止加熱，但整個(gè)反應(yīng)裝置仍處于氬氣氛圍保護(hù)，當(dāng)反應(yīng)瓶降至室溫后再停止氬氣保護(hù)。產(chǎn)物經(jīng)二氯甲烷溶解后，加入無(wú)水乙醇沉淀，得到的沉淀物在60 ℃經(jīng)真空干燥24 h 后得到PDLLA 樣品，并存放到-20 ℃的冰箱中。

1.3.2 反應(yīng)條件對(duì)PDLLA 分子量的影響 （1）催化劑與單體的物質(zhì)的量之比對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量的影響?？刂品磻?yīng)時(shí)間為7.0 h，分別研究在反應(yīng)溫度130、140、150 ℃時(shí)，不同的催化劑與單體的物質(zhì)的量之比（1.15∶5 000、2.04∶5 000、2.66∶5 000、3.02∶5 000、3.38∶5 000、4.44∶5 000）對(duì)產(chǎn)物的數(shù)均分子量的影響。（2）反應(yīng)時(shí)間對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量的影響?？刂拼呋瘎┡c單體物質(zhì)的量之比為2.66∶5 000，分別研究在反應(yīng)溫度為130、140 ℃時(shí)，不同反應(yīng)時(shí)間（1、3、6、9、12、15 h）得到的產(chǎn)物的數(shù)均分子量及單體轉(zhuǎn)化率。（3）反應(yīng)溫度對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量的影響。控制反應(yīng)時(shí)間為6.0 h，分別研究在催化劑與單體的物質(zhì)的量之比為1.15∶5 000、2.04∶5 000、2.66∶5 000 時(shí)，不同反應(yīng)溫度（130、140、150、160、170 ℃）對(duì)產(chǎn)物數(shù)均分子量的影響。（4）正交實(shí)驗(yàn)。通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)PDLLA 的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)各因素水平見表1。

1.3.3 力學(xué)性能測(cè)試 首先將聚合物用平板硫化機(jī)在180 ℃、10 MPa 經(jīng)熱壓制得聚合物薄膜（120 mm×150 mm×0.5 mm），然后將薄膜裁剪成啞鈴型，最后采用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（美特斯工業(yè)系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司CMT-2503）測(cè)試薄膜的力學(xué)性能。測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 1040—2006，樣條拉伸速率10 mm/min，溫度25 ℃，濕度50%，每組5 個(gè)平行樣品。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of orthogonal test

1.3.4 降解性能測(cè)試 使用平板硫化機(jī)在180 ℃、10 MPa 經(jīng)熱壓制得120 mm×150 mm×0.5 mm 的聚合物薄膜，然后將其裁剪成10 mm×10 mm×0.5 mm 的樣品。將薄片置于10 mL pH=7.4 的PBS 緩沖液中，于37 ℃恒溫振蕩箱進(jìn)行材料降解實(shí)驗(yàn)。在到達(dá)預(yù)先設(shè)置的取樣時(shí)間后，取出聚乳酸樣品并用大量去離子水沖洗，經(jīng)濾紙除去樣品表面水分后，測(cè)得其濕態(tài)質(zhì)量，經(jīng)真空干燥48 h 至樣品達(dá)到恒重后測(cè)得此時(shí)的質(zhì)量即為樣品的干態(tài)質(zhì)量，并記錄此時(shí)溶液的pH。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)、每組樣品取3 個(gè)平行樣，記錄每個(gè)樣品的初始質(zhì)量。通過公式（1）計(jì)算樣品的吸水率（ rH2O）：

其中，mi為第i 天樣品的濕態(tài)質(zhì)量，m0為樣品降解前的初始質(zhì)量。

1.3.5 細(xì)胞活性測(cè)試 將熱壓得到的純聚乳酸膜裁剪成10 mm×10 mm×0.5 mm 的樣品，將聚合物膜放置于24 孔板內(nèi)（每孔1 個(gè)樣品），每個(gè)組分取3 個(gè)樣品，在超凈臺(tái)紫外輻照24 h 滅菌。每個(gè)孔板接種2×104個(gè)小鼠成纖維（L929）細(xì)胞后于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1，3 d 和7 d。在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入100 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液（5 mg/mL），繼續(xù)在37 ℃恒溫箱孵育4 h 后，移去每孔的培養(yǎng)基。將薄膜移至新的孔板內(nèi)，每孔用500 μL 二甲基亞砜（DMSO）在37 ℃恒溫振蕩箱溶解所得的甲瓚晶體。15 min 后，每孔取100 μL 液體于96 孔板中，測(cè)定492 nm 處的吸光度（OD）值。

2 結(jié)果與討論

2.1 PDLLA 的合成工藝優(yōu)化

2.1.1 催化劑與單體的物質(zhì)的量之比 圖1 示出了催化劑與單體的物質(zhì)的量之比對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量的影響。當(dāng)反應(yīng)溫度為130 ℃和140 ℃時(shí)，PDLLA 的數(shù)均分子量隨催化劑含量增加呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，這是由于當(dāng)催化劑含量較少時(shí)，隨著催化劑含量的增加，反應(yīng)速率加快，使得聚合物分子鏈快速增長(zhǎng)；而當(dāng)催化劑含量超出某一值時(shí)，鏈增長(zhǎng)中心過多，從而使聚合物數(shù)均分子量反而下降。當(dāng)反應(yīng)溫度為150 ℃時(shí)，聚乳酸數(shù)均分子量則隨催化劑含量增加直接呈下降趨勢(shì)，這是由于高溫會(huì)導(dǎo)致一些副反應(yīng)如解聚反應(yīng)[21,22]發(fā)生，從而使產(chǎn)物鏈長(zhǎng)變短。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間 圖2 示出了反應(yīng)時(shí)間對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量及單體轉(zhuǎn)化率的影響。在所選取的反應(yīng)溫度下，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3～6 h時(shí)，數(shù)均分子量最高；繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，數(shù)均分子量反而呈下降趨勢(shì)，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間高溫條件造成了酯交換等副反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致PDLLA 分子鏈變短[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)6.0 h 時(shí)單體轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，再繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，單體轉(zhuǎn)化率基本維持不變。因此，控制反應(yīng)時(shí)間為6.0 h 可以獲得較大的單體轉(zhuǎn)化率及高分子量的PDLLA。

圖1 催化劑與單體的物質(zhì)的量之比對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量的影響Fig. 1 Effect of molar ratio of catalyst to monomer on the numberaverage molecular weight of PDLLA

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量及單體轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 2 Effect of reaction time on the number-average molecular weight and monomer conversion rate of PDLLA

2.1.3 反應(yīng)溫度 圖3 示出了PDLLA 數(shù)均分子量與反應(yīng)溫度的關(guān)系。當(dāng)催化劑與單體的物質(zhì)的量之比為1.15∶5 000時(shí)，聚合物數(shù)均分子量隨溫度增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在150 ℃有一極值。當(dāng)催化劑與單體的物質(zhì)的量之比為2.04∶5 000 時(shí)，數(shù)均分子量變化趨勢(shì)也是先上升后下降，但數(shù)均分子量的極大值出現(xiàn)在較低的溫度（140 ℃），且數(shù)均分子量要高于物質(zhì)的量之比為1.15∶5 000 的數(shù)均分子量。這可能是由于在一定范圍內(nèi)升高反應(yīng)溫度可增加分子的運(yùn)動(dòng)速率，使得數(shù)均分子量增加。丙交酯經(jīng)開環(huán)聚合得到聚乳酸的過程還伴隨著聚乳酸分子鏈解聚的過程，反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高導(dǎo)致了解聚反應(yīng)速率要快于開環(huán)聚合的速率，最終引起了數(shù)均分子量的下降[24]。當(dāng)催化劑與單體的物質(zhì)的量之比增加至2.66∶5 000 時(shí)，數(shù)均分子量隨反應(yīng)溫度的增加而下降，這是由于引發(fā)劑過多導(dǎo)致引發(fā)位點(diǎn)增加，則在相同單體加入量下，平均到每一引發(fā)點(diǎn)的單體量減少，因此聚合產(chǎn)物的數(shù)均分子量降低。

2.1.4 合成工藝優(yōu)化 從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）及極差分析圖（圖4）可得PDLLA 的最優(yōu)合成工藝為A1B2C1，即溫度選取135 ℃，催化劑與單體物質(zhì)的量之比為2.04∶5 000，反應(yīng)時(shí)間選取4.5 h。如果綜合考慮單體轉(zhuǎn)化率，則反應(yīng)時(shí)間可選為6.0 h。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)PDLLA 數(shù)均分子量影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on the number-average molecular mass of PDLLA

圖4 正交實(shí)驗(yàn)極差分析圖Fig. 4 Range analysis of orthogonal experiment

2.2 材料表征

2.2.1 PDLLA 數(shù)均分子量及熱性能 在上述優(yōu)化合成條件下制備PDLLA，并對(duì)樣品的數(shù)均分子量及熱性能進(jìn)行表征。圖5（a）為通過GPC 測(cè)定的淋洗時(shí)間與信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系，PDLLA 的峰值分子量（Mp）為3.81×105，數(shù)均分子量為2.01×105，分子量分布（PDI）為2.12。圖5（b）為PDLLA 的DSC 曲線，可以看出所得PDLLA 為無(wú)定型聚合物，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）為49.9 ℃。圖5（c）為PDLLA 的熱重曲線，所得PDLLA 的熱分解溫度（Td）為271.1 ℃，證明所制備的PDLLA 具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖5 聚合物的（a）GPC、（b）DSC 與（c）熱重曲線Fig. 5 （a） GPC, （b） DSC and （c） TG curves of PDLLA

2.2.2 PDLLA 的結(jié)構(gòu)表征 從圖6(A)的1H-NMR 譜圖中可以看出：δ=1.56 處是PDLLA 分子鏈上―CH3中的H 原子，δ=5.16 處為PDLLA 骨架上面的―CH2―中的H 原子。從圖6(B) 的紅外光譜圖可以看出：1 743 cm-1處的峰為PDLLA 重復(fù)單元酯鍵中C=O的伸縮振動(dòng)峰，1 034 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于C―O―C 的伸縮振動(dòng)，2 970～2 872 cm-1的峰與―CH3和―CH2―的C―H 鍵的伸縮振動(dòng)相對(duì)應(yīng)，因此，樣品的所有峰都與PDLLA的特征峰一致[25]。

2.2.3 力學(xué)性能 通過上述優(yōu)化的合成工藝制備的PDLLA 的應(yīng)力-應(yīng)變曲線見圖7，PDLLA 的拉伸強(qiáng)度為（39.01±1.34） MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為3.94%±0.54%，彈性模量為（1.68±0.34） GPa。聚乳酸的力學(xué)強(qiáng)度對(duì)其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極其重要，高分子量聚乳酸能展現(xiàn)更好的強(qiáng)度和韌性，適合開發(fā)骨組織修復(fù)支架材料或非承重骨組織的固定材料。

2.2.4 PDLLA 的降解性能 圖8（a）為PDLLA 在PBS 溶液中的吸水率及質(zhì)量變化曲線，圖8（b）為PDLLA 降解過程中溶液pH 的變化曲線。初始100 d 內(nèi)PDLLA 的質(zhì)量變化不明顯，在100～220 d 出現(xiàn)較明顯的質(zhì)量減少，220 d 后則出現(xiàn)急速的質(zhì)量減少。PDLLA 的吸水率變化趨勢(shì)則與之相反：初始100 d 吸水率較小，100～220 d 吸水率顯著上升，220 d 后吸水率迅速上升。PDLLA 的降解速率與其吸水率有關(guān)，降解前期PDLLA 材料致密性較高，能降低體液溶脹侵蝕的速率，從而能減緩材料降解速率并維持較高的強(qiáng)度。隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)，材料結(jié)構(gòu)變得疏松，水分對(duì)PDLLA 的侵蝕速率加快，因此材料的降解速率加快，從而導(dǎo)致了材料的破裂（圖9）[26]。溶液pH 在初期變化不大，可能是前期降解速率較慢的原因，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，降解速率加快，乳酸的積累增多，這些因素使得PDLLA 降解速率明顯加速，導(dǎo)致pH 顯著降低[27]。進(jìn)一步觀察PDLLA 膜膜在降解過程的微觀變化（圖10），可以看出材料在降解前的表面及斷面較為平滑，經(jīng)過240 d 降解后，材料表面粗糙，伴隨有大量微孔和顆粒產(chǎn)生。材料降解后斷面內(nèi)產(chǎn)生的孔明顯大于表面，這一現(xiàn)象進(jìn)一步證明PDLLA 內(nèi)部降解要快于外部。這可能是因?yàn)镻DLLA 材料首先吸水溶脹接著發(fā)生水解反應(yīng)，此過程會(huì)釋放出酸度較高的乳酸，通常材料表面的乳酸降解產(chǎn)物比較容易被緩沖溶液中和或淋洗帶走，而內(nèi)部降解產(chǎn)生的乳酸不易排出，因此易造成內(nèi)部乳酸的過多積蓄，導(dǎo)致內(nèi)部降解速率較快，而表面降解速率反而較慢[28]。

圖7 PDLLA 的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig. 7 Stress-strain curve of PDLLA

圖8 PDLLA 降解曲線：（a）吸水率及質(zhì)量變化曲線；（b）pH 變化曲線Fig. 8 Degradation profile of PDLLA: （a） water absorption rate and mass variation; （b） pH variation

圖9 PDLLA 的外觀照片：（a）降解前；（b）降解28 d；（c）降解240 dFig. 9 Digitalphotos of PDLLA: （a） before degradation; degraded after （b） 28 d and （c） 240 d

圖10 PDLLA 降解前后的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 10 SEM images of PDLLA before and after degradation

2.2.5 細(xì)胞活性 選擇L929 為模型細(xì)胞，采用MTT 法評(píng)估了其在PDLLA 膜上1，3，7 d 的細(xì)胞活性，結(jié)果如圖11 所示。結(jié)果表明，PDLLA 薄膜表面的細(xì)胞增殖量要高于空白對(duì)照組，表明PDLLA 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，且有助于細(xì)胞的增殖。

3 結(jié) 論

圖11 L929 細(xì)胞在PDLLA 膜表面的細(xì)胞活性Fig. 11 Cell vaibility of L929 cells cultured on the surface of PDLLA membranes

（1）D, L-LA 開環(huán)聚合生成PDLLA 的最佳合成條件：反應(yīng)溫度為135 ℃，催化劑與單體物質(zhì)的量之比為2.04∶5 000，反應(yīng)時(shí)間選取4.5 h，如果綜合考慮單體轉(zhuǎn)化率的話，反應(yīng)時(shí)間可選為6.0 h。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件所得聚乳酸的數(shù)均分子量為2.01×105，拉伸強(qiáng)度為（39.91±1.34） MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為3.94%±0.54%，彈性模量為（1.68±0.34） GPa。

（2）PDLLA 薄膜可促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞的增殖。