中藥冠通方對心梗后心功能不全大鼠心肌細胞PGC-1α和AMPK蛋白的影響

韋 斌，莫雪梅，王 強，姜 浩，葉星江，林洪升，盧健棋

（1.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.武警廣西總隊醫(yī)院，廣西 南寧 530003；3.廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；4.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

心功能不全是由于各種原因導致心臟泵血功能下降，排血量絕對或相對不足，使血液在脈管運行不暢所致的一種病理狀態(tài)。早期心功能不全屬于無明顯癥狀的心力衰竭，此時心臟發(fā)揮代償功能，如不進行治療，將發(fā)展為有癥狀的慢性心力衰竭。心肌梗死（簡稱“心?！保┖笮墓δ懿蝗ê喎Q“心衰”）是臨床上心功能不全發(fā)生的常見類型［1］。雖然心梗診療手段的進步提高了患者的生存率，但是心梗后心衰常導致預后不良，心衰的發(fā)病率、死亡率高，是多種器質性心臟病患者幾乎不可避免的結局。中醫(yī)認為心衰的病因病機為本虛標實之證。中藥冠通方在臨床上治療心力衰竭有良好療效［2］，本研究觀察中藥冠通方對心梗后心衰大鼠心肌細胞過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助激活因子-1α（PGC-1α）和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）蛋白的影響，探討中藥治療心衰的機理。

1 實驗材料

1.1 動物 SD雌性大鼠，體質量250～320 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2017-0023；動物飼料由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品及主要試劑 冠通方顆粒（由人參、三七、丹參、黃芪、地龍、全瓜蔞、絞股藍、陳皮等組成），由廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格為每包3.5 g（每克相當于含生藥4 g）；卡托普利片（中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品，國藥準字H31022816，規(guī)格：每片25 mg）；PGC-1α（ABCAM公司）；AMPK抗體（ABCAM公司）；二抗（ABCAM公司）；Western blot凝膠試劑盒（碧云天公司）。

1.3 儀器 DW-3000型小動物呼吸機（北京智鼠多寶生物科技有限公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一廠）。

2 實驗方法

2.1 心梗后心衰大鼠動物模型的制作 參考文獻［3］的造模方法：大鼠予10%的水合氯醛（4 ml/kg）麻醉，麻醉后固定，監(jiān)測大鼠心電圖，無創(chuàng)氣管并插管，連接小動物呼吸機進行正壓通氣，潮氣量約7 ml，呼吸頻率70次/分鐘；呼吸比為2∶1。在胸骨左緣捫及心臟搏動處縱行切開皮膚約2 cm，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，剪斷第三、四肋間開胸，充分暴露心臟。用生理鹽水潤濕棉球保護肺臟組織，小心剝離心包膜，在肺動脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標志，盡可能找到冠狀動脈前降支，于左心耳根部下方5 mm處以2/0縫合針線穿過并結扎左冠狀動脈前降支（LAD），以心電圖ST段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)5 min以上作為結扎成功的標志，最后清除胸腔積血并縫合關閉胸腔。假手術組只穿針線不結扎。

2.2 分組與給藥 手術前隨機抽取6只大鼠作為假手術組，其余18只大鼠按2.1項方法進行造模。手術3 d后，將心梗后心衰模型大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組：模型對照組、冠通方組、卡托普利組。大鼠分組后分籠飼養(yǎng)，每天早上9點定時灌胃，藥物用量根據(jù)人-大鼠臨床用藥劑量換算公式［4］換算成大鼠用藥量。假手術組和模型對照組予生理鹽水灌胃；冠通方組灌服給予冠通方溶液，劑量為2.5 g/（kg·d）；卡托普利組灌服給予卡托普利溶液，劑量為0.002 5 g/（kg·d）。各組連續(xù)給藥4周，于末次給藥2 h后進行取材。

2.3 標本采集及指標檢測 取左室心肌100 mg，提取蛋白后采用Western blot半定量測定。應用非連續(xù)梯度SDS-PAGE電泳進行分離（AMPK的分子量約為62 kD，分離膠的濃度為8%；PGC-1α的分子量約為91 kD，分離膠的濃度為8% ；濃縮膠的濃度均為6%）。轉入PVDF膜上，先用5%的脫脂奶室溫封閉2 h，再分別用抗AMPK或PGC-1α的一抗于4℃孵育過夜。將膜洗滌2遍后，分別用1∶5 000標記有過氧化物酶的羊抗兔或兔抗羊的二抗，37℃孵育2 h。充分洗滌后，加入ECL超敏發(fā)光試劑發(fā)光，壓片時間1 min，測定各條帶的灰度值。記錄時，各蛋白的表達水平以相應區(qū)帶的灰度值相對于內參β-actin灰度的比值代表其相對含量。

2.4 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學處理應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件做數(shù)據(jù)處理分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間兩兩比較，用單因素方差分析，以P＜0.05為有顯著性差異。

3 結 果

3.1 動物一般情況 心梗后心衰模型大鼠精神萎靡，毛發(fā)蓬松，反應遲鈍，活動減少，能進食進水，尿量增多，毛色蠟黃、臟亂粗糙。給予青霉素治療1周后，大鼠一般狀態(tài)良好，精神恢復，反應靈敏，活動自如，能梳理毛發(fā)，毛發(fā)顏色逐漸被梳理整潔。

3.2 心肌細胞觀察

3.2.1 心肌細胞肉眼觀察情況 解剖大鼠可見，造模大鼠的心臟可見殘留的線頭和纖維化的壞死區(qū)，心尖部鈍圓略呈球形，橫切面可見心腔擴大，未壞死區(qū)心肌飽滿，心室壁肌層稍厚，壞死區(qū)域呈灰白色纖維化膜，失去肌肉組織，從外觀上看，心肌細胞可能發(fā)生心肌重塑。假手術組心臟大小正常，未見畸形變化。

3.2.2 心肌細胞顯微結構 見圖1。假手術組心肌細胞形態(tài)結構完整，大小相同，肌纖維排列緊密且有序規(guī)則。模型對照組部分區(qū)域心肌大小不一，排列不規(guī)則，心肌細胞梗死區(qū)由纖維瘢痕組織代替，壞死區(qū)心室壁變薄，壞死區(qū)邊緣心肌排列松散，不規(guī)則，心肌細胞增大，表明大鼠心梗造模成功。冠通方組、卡托普利組均可見心肌細胞代償性增大，排列整齊，心肌纖維橫紋較粗大。

圖1 各組心肌細胞顯微結構HE染色圖 （×200）

3.3 各組PGC-1α、AMPK蛋白表達量比較 見圖2、圖3和表1。

圖2 各組PGC-1α表達條帶

圖3 各組AMPK蛋白表達條帶

表1 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、AMPK蛋白表達量比較 （±s）

表1 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、AMPK蛋白表達量比較 （±s）

注：與假手術組比較，①P＜0.05；與模型對照組比較，②P＜0.05

組 別假手術組模型對照組冠通方組卡托普利組n 6 6 6 6劑量（g/kg）— —2.5 0.002 5 PGC-1α 0.604±0.018 0.392±0.014①0.535±0.035②0.495±0.053②AMPK蛋白0.876±0.030 0.760±0.047①0.858±0.035②0.810±0.012②

表1結果顯示，與假手術組比較，模型對照組的PGC-1α、AMPK蛋白均顯著降低（P＜0.05），表明大鼠心梗造模成功；與模型對照組比較，冠通方組和卡托普利組的PGC-1α、AMPK蛋白均顯著升高（P＜0.05），提示冠通方和卡托普利可促進心梗后心衰心肌細胞的PGC-1α和AMPK蛋白表達，從而達到保護心肌細胞的作用。

4 討論

過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助激活因子-1α（PGC-1α）是一種功能強大的轉錄調節(jié)輔助激活因子，能夠調節(jié)線粒體ATP的合成，刺激線粒體生物合成，促進肝糖原的異生以及脂肪酸β氧化等一系列能量代謝。因此，PGC-1α是心肌細胞能量代謝的一個重要蛋白分子［5-7］。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是一種在真核細胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［8］。AMPK激活后，通過影響線粒體生成、蛋白質合成及分解在細胞的生長和分化過程中發(fā)揮重要作用［9-10］。研究表明，通過AMPK等途徑介導活化PGC-1α，能激活下游的核呼吸因子、線粒體轉錄因子A，增強心肌線粒體的功能，促進ATP的生成，給心肌細胞提供能量［11-12］。通過促進AMPK等途徑而激活PGC-1α，可能是冠通方治療心力衰竭的靶點。

慢性心衰屬祖國醫(yī)學“喘證”“水腫”等范疇，屬本虛標實、虛實夾雜之證［13-15］，慢性心衰的中醫(yī)病理機制是心氣虛乏、運血無力，冠通方正是基于冠心病“正氣虛于內，痰瘀血痹于中”之病機認識，采用益氣養(yǎng)陰、清熱解毒化痰、行氣活血、化瘀通絡的原則立法遣方，具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒化痰、行氣活血、化瘀通絡之功，諸藥合用切中病機?，F(xiàn)代研究表明，冠狀動脈結扎術后導致心肌細胞壞死，壞死區(qū)周圍的心肌細胞發(fā)生凋亡，心功能不全逐漸惡化。冠通方是方顯明教授在長期的醫(yī)療實踐中總結出來的復方制劑［16］。已有的研究表明，絞股藍對缺血心肌具有保護作用［17］；丹參具有擴張冠狀動脈、抗氧化、保護心肌細胞等作用［18］；人參治療慢性心功能衰竭具有強心、減輕心臟前后負荷、減少心肌對氧的需求量、改善心臟內微循環(huán)等作用［19-20］；黃芪可通過抑制磷酸二酯酶和鈣調蛋白的活性，減少cAMP的分解，增加鈣內流和肌漿網(wǎng)內鈣釋放，加強心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)，產(chǎn)生強心作用，其作用強度與劑量呈正相關［21-22］。許多試驗亦證明黃芪具有明顯的正性肌力作用，其作用類似非洋地黃類正性肌力藥物。

本研究建立心梗后誘發(fā)心衰的實驗大鼠模型，實驗結果表明，PGC-1α和AMPK蛋白在模型對照組中表達明顯降低，與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），用冠通方和卡托普利片干預后，大鼠心肌細胞PGC-1α和AMPK蛋白表達明顯升高，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示冠通方可促進心梗后心衰心肌細胞的PGC-1α和AMPK蛋白的表達，從而達到保護心梗后心肌細胞的作用。