婦安消疹洗液對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

何秀麗，景海霞，李 炯，劉文韜，杜 曉，常明泉

（1.十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

婦安消疹洗液是十堰市太和醫(yī)院制劑（批準(zhǔn)文號：鄂藥制字Z20180417，規(guī)格：每瓶250 ml，生藥含量0.672 g/ml），該藥物具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、殺蟲止癢、收斂的作用，用于濕疹、丘疹性蕁麻疹、皮膚瘙癢、體股癬、汗皰疹、接觸性皮炎等治療，在婦科主要用于婦科腔道炎癥沖洗等［1］。近年來，該洗液在臨床上的用途得到擴(kuò)展，廣受患者歡迎，而其藥理機(jī)制研究尚屬空白，為進(jìn)一步明確其藥理作用，為臨床合理用藥、安全用藥提供理論依據(jù)，筆者擬建立小鼠實驗動物模型，對其抗Ⅳ變態(tài)反應(yīng)的藥理作用進(jìn)行實驗研究。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 二硝基氯苯（DNCB，武漢江岸化試有限公司提供，規(guī)格：100 g，含量98.0%，批號：20161206）；4-氨基吡啶（4-AP，阿爾法公司生產(chǎn)，規(guī)格:100 g，含量94.1%，批號:20170411）；磷酸組織胺（上海哈靈生物科技有限公司提供，規(guī)格：250 mg，含量99.0%，批號:20161513）；0.9%氯化鈉溶液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：250 ml，批號:L118060801）；地奈德乳膏（重慶華邦制藥有限公司生產(chǎn)，批號：20180319）；標(biāo)準(zhǔn)婦安消疹洗液（十堰市太和醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，含生藥0.672 g/ml，批號：201801116）；高劑量婦安消疹洗液（取標(biāo)準(zhǔn)婦安消疹洗液500 ml，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至250 ml，含生藥1.344 g/ml，臨時配制）；中劑量婦安消疹洗液（取標(biāo)準(zhǔn)婦安消疹洗液250 ml，含生藥0.672 g/ml，臨時配制）；低劑量婦安消疹洗液（取標(biāo)準(zhǔn)婦安消疹洗液加純化水按1∶1比例稀釋，含生藥0.336 g/ml，臨時配制）。

1.2 實驗動物 C57BL/6/ICR小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，周齡6，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2016-0008；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2016-0031；飼養(yǎng)條件：恒溫、恒濕，每天給予固體飼料和足量維生素，自由飲水。

1.3 實驗數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件處理，各組實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間實驗結(jié)果的分析應(yīng)用方差法，成對組間結(jié)果分析應(yīng)用LSD-t檢驗法。

1.4 婦安消疹洗液對Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用 取健康小鼠72只，隨機(jī)將其分為6組，各組12只，雌雄各半，分組情況為:婦安消疹洗液高劑量組、婦安消疹洗液中劑量組、婦安消疹洗液低劑量組、地奈德組、模型組、空白組。將每組小鼠腹部、兩耳廓剃毛，左耳廓外搽給藥，右耳做對照?？瞻捉M、模型組每只小鼠給予0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/cm2，地奈德組每只小鼠給予地奈德乳膏0.05 g/cm2，婦安消疹洗液高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)濃度的婦安消疹洗液0.1 ml/cm2；每天1次，持續(xù)給藥7 d。除空白組外，其他5組小鼠在第1次給藥24 h后，在腹部和左耳廓剃毛處給予5%DNCB丙酮溶液0.05 ml涂抹致敏，第2天再給予5%DNCB丙酮溶液0.05 ml增強，第3、4、5天不給藥，第6天再給予5%DNCB丙酮溶液0.05 ml，給藥1 h后在小鼠左耳廓內(nèi)外兩面都均勻涂抹5%DNCB丙酮溶液，劑量為20 μl，施行激敏攻擊，激敏攻擊1 h后處死小鼠，左右耳對應(yīng)部位分別用直徑6 mm的打孔器打取相同面積的耳片，用分析天平稱取雙耳片重量，計算耳腫脹度［耳腫脹度 =左耳重量（mg）－右耳重量（mg）］；依法摘取小鼠胸腺，用分析天平稱重，計算胸腺指數(shù)［胸腺指數(shù) = 胸腺重量（mg）/體重（g）×10］；依法摘取小鼠脾臟，用分析天平稱重，計算脾臟指數(shù)［脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/體重（g）×10］。

1.5 婦安消疹洗液對4-AP致癢反應(yīng)的抑制作用 取健康小鼠72只，隨機(jī)將其分為6組，各組12只，雌雄各半，分組情況為:婦安消疹洗液高劑量組、婦安消疹洗液中劑量組、婦安消疹洗液低劑量組、地奈德組、模型組、空白組。實驗前24 h，將小鼠背部剃毛約2 cm×2 cm，謹(jǐn)慎操作，避免傷及皮膚，剃毛完畢后查看每只小鼠剃毛區(qū)域是否有皮膚破損，將剃毛區(qū)皮膚有損傷的小鼠淘汰［2-3］?？瞻捉M、模型組小鼠均給予0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/cm2，地奈德組給予地奈德乳膏0.05 g/cm2，婦安消疹洗液的高、中、低劑量組小鼠分別給予相應(yīng)濃度的婦安消疹洗液0.1 ml/cm2；每日1次，持續(xù)給藥7 d。于末次給藥30 min后，婦安消疹洗液高劑量組、婦安消疹洗液中劑量組、婦安消疹洗液低劑量組、地奈德組、模型組每只小鼠在背部剃毛處皮下注射4-AP（注射劑量按1 mg/kg計算），空白組在背部剃毛處注射相同劑量的0.9%氯化鈉溶液。給藥結(jié)束后觀察各組動物在10 min內(nèi)的反應(yīng)，小鼠連續(xù)舔體直至短暫停頓時記錄為1次舔體。

1.6 婦安消疹洗液對磷酸組織胺致癢閾的影響 取健康小鼠50只，將其隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半，即婦安消疹洗液高劑量組、婦安消疹洗液中劑量組、婦安消疹洗液低劑量組、地奈德組、模型組。實驗前24 h，將各組小鼠左后足背剃毛，婦安消疹洗液的高、中、低劑量組小鼠分別給予相應(yīng)濃度的婦安消疹洗液0.1ml/cm2；模型組給予0.9%氯化鈉溶液0.1ml/cm2；地奈德組給予地奈德乳膏0.05 g/cm2。實驗時，取零號砂紙磨擦實驗小鼠左后足剃毛部位，磨擦面積約1 cm2，磨擦程度以表皮有輕度出血、輕度損傷為度，備皮成功，每只實驗小鼠在皮損部位滴加濃度為0.01%的磷酸組織胺溶液0.05 ml，隨后每5分鐘追加磷酸組織胺溶液 1次（0.05 ml），濃度依次按 0.01%、0.02%、0.03%……0.1%遞增，實驗時注意觀察動物表現(xiàn)，待小鼠扭頭舔左后足時停止給藥，所用磷酸組織胺溶液的總劑量即為致癢閾。

2 結(jié)果

2.1 婦安消疹洗液對Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的抑制結(jié)果 試驗結(jié)果顯示，5%DNCB丙酮溶液可引起模型組小鼠耳腫脹度、胸腺、脾臟指數(shù)顯著增加，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05）；婦安消疹洗液各劑量均能不同程度抑制5%DNCB丙酮溶液引起的小鼠Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，而中、高劑量組對小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)抑制效果與模型組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；婦安消疹洗液局部外用可抑制5%DNCB丙酮溶液誘發(fā)的小鼠Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，且存在一定的量效關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 各組對DNCB所致小鼠Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用 （±s）

表1 各組對DNCB所致小鼠Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的抑制作用 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別空白組模型組地奈德組婦安消疹洗液低劑量組婦安消疹洗液中劑量組婦安消疹洗液高劑量組n 給藥劑量12 12 12 12— —0.05 g/cm2 0.1 ml/cm2耳腫脹度（mg）0.7±0.3 23.1±5.4①12.5±2.2②19.6±3.3胸腺指數(shù)（mg/g）1.197±0.281 2.399±0.525①1.286±0.435②1.941±0.317脾臟指數(shù)（mg/g）1.542±0.587 3.723±0.486①2.198±0.215②3.574±0.276 120.1 ml/cm214.9±2.6②1.657±0.391②2.731±0.312②120.1 ml/cm212.7±2.4②1.356±0.523②2.128±0.333②

2.2 婦安消疹洗液對4-AP致癢反應(yīng)結(jié)果 注射4-AP后，與空白組比較，模型組小鼠舔體反應(yīng)次數(shù)顯著增多（P＜0.05）；從舔體次數(shù)比較，婦安消疹洗液低、中、高劑量組對4-AP的止癢效果具有一定的量效關(guān)系，與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明婦安消疹洗液低、中、高劑量均能顯著抑制4-AP誘發(fā)的瘙癢反應(yīng)。結(jié)果見表2。

表2 各組由4-AP誘發(fā)舔體反應(yīng)的次數(shù)（±s）

表2 各組由4-AP誘發(fā)舔體反應(yīng)的次數(shù)（±s）

注:與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別空白組模型組地奈德組婦安消疹洗液低劑量組婦安消疹洗液中劑量組婦安消疹洗液高劑量組n 給藥劑量12 12 12 12——0.05 g/cm2 0.1 ml/cm2舔體反應(yīng)次數(shù)（次/10 min）6.1±2.6 33.9±8.4①21.8±7.1②25.5±10.3②120.1 ml/cm223.2±9.7②120.1 ml/cm221.5±6.1②

2.3 婦安消疹洗液對磷酸組織胺致癢閾影響結(jié)果 婦安消疹洗液各劑量組、地奈德組的磷酸組織胺致癢閾顯著高于模型組（P＜0.05），婦安消疹洗液低、中、高劑量對小鼠磷酸組織胺致癢閾的提升效應(yīng)依次升高，存在量效關(guān)系。婦安消疹洗液中劑量組致癢閾與地奈德組接近，高劑量組顯著高于地奈德組（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠磷酸組織胺致癢閾測定的結(jié)果（±s）

表3 各組小鼠磷酸組織胺致癢閾測定的結(jié)果（±s）

注:與模型組比較，①P＜0.05；與地奈德組比較，②P＜0.05

組 別n 給藥劑量 致癢閾（μg）模型組地奈德組婦安消疹洗液低劑量組婦安消疹洗液中劑量組婦安消疹洗液高劑量組10 10 10—0.05 g/cm2 0.1 ml/cm2 85.2±26.2 306.9±44.2①180.6±33.7①100.1 ml/cm2298.6±41.4①100.1 ml/cm2364.9±69.5①②

3 討論

Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)是由特異性致敏效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的一種類型，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-2反作用于中樞免疫器官，胸腺內(nèi)的T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)早期T淋巴細(xì)胞向CD8+單陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使凋亡的雙陽性細(xì)胞減少，進(jìn)而使胸腺增重，胸腺指數(shù)變大；大量初始T淋巴細(xì)胞同時識別特異性變應(yīng)原及免疫相關(guān)分子發(fā)生活化效應(yīng)，產(chǎn)生包括IL-2在內(nèi)的多種淋巴因子，刺激CD4+T淋巴大量增殖，造成相應(yīng)的脾臟重量增加，脾臟指數(shù)變大；在小鼠體中，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原的Ⅳ型超敏反應(yīng)均可經(jīng)CD4+T細(xì)胞被動轉(zhuǎn)移；皮膚源性瘙癢是由組胺敏感性的無髓C類神經(jīng)纖維進(jìn)行傳導(dǎo)的，在濕疹、特異性皮炎等皮膚疾病的病理過程中，Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)所釋放的炎癥介質(zhì)也與皮膚瘙癢的產(chǎn)生有密切的關(guān)系［4-6］。

研究發(fā)現(xiàn)，婦安消疹洗液對DNCB誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹、胸腺腫脹、脾腫脹具有顯著的抑制作用，并能顯著抑制4-AP誘導(dǎo)的瘙癢反應(yīng)、提升磷酸組織胺致癢閾，這與婦安消疹洗液組方藥物所含活性成分有關(guān)。婦安消疹洗液是以野菊花、苦參、漏蘆、土茯苓、蛇床子、白礬6味中藥組方，經(jīng)過水煎提取、過濾、沉淀、離心、濃縮、滅菌等工藝制備而得的一種中藥復(fù)方外用洗液。野菊花素有中藥“廣譜抗生素”之稱，所含糖苷、黃酮、萜類具有抗炎、抗病毒作用，對金葡菌、綠膿桿菌等抑菌力強［7］，用于消除小鼠變態(tài)反應(yīng)皮損處炎癥；苦參堿［8］、蛇床子素［9］具有抗組胺樣作用，殺蟲止癢、抗過敏，對DNCB誘導(dǎo)的小鼠變態(tài)反應(yīng)、瘙癢能產(chǎn)生較強的抑制作用；蛇床子中的花椒毒酚［10］具有一定的鎮(zhèn)痛與表面麻醉效果，對4-AP誘發(fā)的小鼠瘙癢反應(yīng)與炎癥因子能產(chǎn)生良好的抑制作用，可能通過抑制N-型鈣通道，阻滯小鼠神經(jīng)傳導(dǎo)、鈍化皮下外周神經(jīng)對瘙癢的反應(yīng)，從而提升磷酸組織胺致癢閾；白礬具有較強的蛋白凝固作用，低濃度有收斂、消炎、防腐作用，其溶液通過進(jìn)入小鼠皮下組織細(xì)胞，抑制、延遲細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)，降低免疫球蛋白與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，抑制白介素的合成與釋放，促進(jìn)Th1/Th2的平衡，產(chǎn)生免疫抑制作用，從而改善外周免疫狀態(tài)［11］；土茯苓中的落新婦苷、漏蘆中的噻吩類、萜類物質(zhì)具有抗菌消癰，改善外周微循環(huán)的功效，通過抑制組胺、毒性物質(zhì)的釋放減輕DNCB誘導(dǎo)小鼠的耳腫脹、胸腺腫脹、脾腫脹等變態(tài)反應(yīng)［12-13］。實驗中所用對照藥物地奈德乳膏屬于糖皮質(zhì)激素乳膏，對接觸性皮炎、脂溢性皮炎、神經(jīng)性皮炎、銀屑病具有良好的治療作用［14］。

婦安消疹洗液具有抗Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)、止癢、提升磷酸組織胺對小鼠致癢閾的作用，該制劑在臨床可用于具有Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)特征的皮損治療。隨著藥理作用的明確其用途越來越寬泛，不僅在成人、而且在兒童群體中陸續(xù)也有些應(yīng)用，盡管在臨床應(yīng)用方面療效得到肯定，但其藥理機(jī)制、適宜性需要得到進(jìn)一步驗證和甄別，在不同年齡人群的用量用法需要通過多角度的藥理研究提供科學(xué)依據(jù)。通過婦安消疹洗液對小鼠抗Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的實驗研究可填補該制劑藥理及基礎(chǔ)研究的部分空白，為該制劑在臨床中的合理、科學(xué)、安全用藥提供依據(jù)。