UPLC法同時(shí)測(cè)定佛手散水煎劑中4種藥效成分含量

賈智若，陳明偉，李文秀，陳美安，甄漢深

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

佛手散，又名芎湯，出自《普濟(jì)本事方》卷十，由當(dāng)歸、川芎藥對(duì)等比例配伍組方，是養(yǎng)血活血、行氣散瘀的中醫(yī)經(jīng)典方劑，近年臨床上多用于腦中風(fēng)、腦動(dòng)脈硬化癥、深靜脈血栓等心腦血管疾病的治療，療效確切［1-5］。

本課題組前期對(duì)佛手散水煎劑的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)佛手散水煎劑成分較為復(fù)雜，主要由有機(jī)酚酸類(lèi)和苯酞類(lèi)成分組成。其中酚酸類(lèi)代表成分阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化等作用，而苯酞類(lèi)代表成分洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯被證實(shí)是對(duì)心腦血管起保護(hù)作用的主要成分，這4種有效成分的藥效與佛手散的藥理作用相吻合［5-7］。目前關(guān)于佛手散水煎劑有效成分含量測(cè)定已有一些報(bào)道，多見(jiàn)于對(duì)其中單個(gè)有效成分的含量測(cè)定［8-10］，多種活性成分同時(shí)測(cè)定的方法鮮有報(bào)道，也未見(jiàn)采用超高效液相色譜法（UPLC）測(cè)定的報(bào)道。本試驗(yàn)建立UPLC法同時(shí)測(cè)定佛手散水煎劑中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，以期為該方湯劑的質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；FD-5N冷凍干燥機(jī)（日本Eyela株式會(huì)社）；BP211D電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；LG16-W型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；HKD-100超純水機(jī)（深圳Pnike公司）。

1.2 試藥與試劑 當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels（批號(hào)20130401）、川芎Ligusticum chunxiong Hort.（批號(hào)20130215）飲片購(gòu)自廣東紫云軒藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧教授鑒定符合藥典要求；阿魏酸對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773-201313）；藁本內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111737-201305）；洋川芎內(nèi)酯A（深圳伽馬科技有限公司，含量為98%，批號(hào)：20130301）；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（深圳伽馬科技有限公司，含量為98%，批號(hào)：20130405）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC液相色譜條件 Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A相為甲醇，B相為0.2%醋酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫：0～5 min，A相保持5%；5～20 min，A 相從5%線(xiàn)性改變至20%；20～40 min，A相從20%線(xiàn)性改變至40%；40～65 min，A相從40%改變至80%；流速：0.2 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：5 μl；柱溫：30℃。對(duì)照品及供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 UPLC色譜圖

2.2 佛手散水煎劑的制備 按處方比例（1∶1）精密稱(chēng)取當(dāng)歸、川芎粗粉各30g，加10倍量水浸泡30min，煎煮3次，每次60 min，濾過(guò)，合并3次濾液，減壓濃縮后得生藥含量為0.2g/ml的佛手散水煎劑，經(jīng)冷凍干燥制成粉末，備用。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對(duì)照品各適量，分別置于棕色量瓶中，加甲醇配制成含阿魏酸1.88 mg/ml、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ0.92 mg/ml、洋川芎內(nèi)酯A 1.22 mg/ml、藁本內(nèi)酯0.68 mg/ml的對(duì)照品貯備溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取佛手散凍干粉0.501 1 g，置于5 ml棕色量瓶中，加去離子水溶解，定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密吸取2.3項(xiàng)下各對(duì)照品貯備液適量，置于同一10 ml棕色量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯濃度依次為382.9μg/ml、371.1μg/ml、97.21 μg/ml、27.62 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μl測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各自的回歸方程和線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。4個(gè)化合物在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，靈敏度較高。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程及線(xiàn)性范圍

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批佛手散水煎劑樣品，于1 d內(nèi)連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，連續(xù)3 d分別進(jìn)樣分析，記錄阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的峰面積值，計(jì)算4種成分的日內(nèi)精密度（n=6）和日間精密度（n=3），結(jié)果顯示阿魏酸的日內(nèi)精密度RSD為0.79%，日間精密度RSD為1.08%；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的日內(nèi)精密度RSD為1.01%，日間精密度RSD為1.49%；洋川芎內(nèi)酯A的日內(nèi)精密度RSD為0.94%，日間精密度RSD為1.35%；藁本內(nèi)酯的日內(nèi)精密度RSD為1.15%，日間精密度RSD為2.05%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份佛手散供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣5 μl，分別測(cè)定各指標(biāo)成分的峰面積。在12 h內(nèi)阿魏酸的平均含量為0.971 1 mg/g，RSD為0.92%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的平均含量為0.737 9 mg/g，RSD為1.56%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯A的平均含量為0.226 0 mg/g，RSD為1.93%（n=6）；藁本內(nèi)酯的平均含量為0.067 9 mg/g，RSD為1.71%（n=6），表明樣品至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批佛手散樣品，按2.4項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μl測(cè)定。阿魏酸的平均含量為1.033 5 mg/g，RSD為0.46%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的平均含量為0.816 6 mg/g，RSD為1.81%（n=6）；洋川芎內(nèi)酯A的平均含量為0.287 8 mg/g，RSD為1.55%（n=6）；藁本內(nèi)酯的平均含量為0.071 6 mg/g，RSD為1.78%（n=6）。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的佛手散樣品粉末（過(guò)三號(hào)篩）6份，每份約0.25 g，精密稱(chēng)定，置半微量圓底燒瓶中，分別準(zhǔn)確加入低、中、高3個(gè)濃度各2份的對(duì)照品貯備液適量，加水2.5 ml回流煎煮3次，每次60 min，濾過(guò)，濾渣洗滌2次，合并濾液，濃縮定容至5 ml，搖勻，靜置，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5μl測(cè)定分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.10 樣品測(cè)定 分別稱(chēng)取3批佛手散凍干粉樣品，按2.4供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備，吸取5 μl供試品溶液進(jìn)樣分析，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算佛手散煎劑中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A以及藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 佛手散煎劑中4種藥效成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討 論

本研究為使各成分獲得最大靈敏度和分離度，同時(shí)又簡(jiǎn)化操作，先采用DAD檢測(cè)器對(duì)阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)脂A、藁本內(nèi)脂此4種藥效成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，再根據(jù)各成分最大吸收波長(zhǎng)與含量的多少，最終確定各成分檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。鑒于佛手散水煎劑成分復(fù)雜，采用常規(guī)的等度洗脫條件難以實(shí)現(xiàn)對(duì)此4種成分的有效分離，為此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中又分別選取不同的流動(dòng)相系統(tǒng)及梯度洗脫條件對(duì)樣品進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果以甲醇-0.2%醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫基線(xiàn)平穩(wěn)，各色譜峰分離度佳。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，僅以其中單一成分為指標(biāo)的質(zhì)量控制方法顯然有失偏頗，由單一成分定量向多指標(biāo)、多成分定量是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展方向。目前佛手散水煎劑以及單味藥當(dāng)歸和川芎水煎劑的含量測(cè)定均有報(bào)道，多以單個(gè)阿魏酸或川芎嗪為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定［8-10］。本試驗(yàn)建立了UPLC法在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定佛手散水煎劑中4種藥效成分的方法，不同批次樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，建立的方法具有良好的重現(xiàn)性與適用性，可較全面地評(píng)價(jià)佛手散水煎劑的質(zhì)量，可為佛手散水煎劑及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。