藤茶雙氫楊梅樹皮素聯(lián)合環(huán)磷酰胺抗腫瘤作用研究

潘翠柳，陸小蓮，吳捷梅，黃裕華，唐云麗，梁臣艷，鄭作文，黃美玲

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

惡性腫瘤是人類面臨的重大難題，已經(jīng)成為影響我國居民健康及威脅生命的疾病之一［1-3］?；熕幬镌谥委煇盒阅[瘤方面具有重要的地位，但化療藥物具有較大的毒副作用［4］。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物和對化療藥具有減毒增效作用的輔助藥物成為目前研究的熱點(diǎn)。

藤茶系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄Ampelop?sis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang，主要用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎等病癥［5］。其主要成分雙氫楊梅樹皮素（APS）是該植物中含量最高的黃酮類化合物［6］，多項(xiàng)研究表明，APS具有抗炎鎮(zhèn)痛［7-8］、抗腫瘤［9-13］、降血糖及降血脂［14-15］、抗氧化［16］、抗過敏［17］、抗粥樣硬化［18-19］、保肝［20-21］等藥理作用?；谇捌谘芯炕A(chǔ)，本文建立H22荷瘤小鼠模型，探討APS對化療藥環(huán)磷酰胺（CTX）抗腫瘤的增效減毒作用，為后續(xù)深入研究藤茶黃酮類化合物及臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 健康SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK（桂）2009-0002。

1.2 細(xì)胞株及試藥 H22細(xì)胞由廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；雙氫楊梅樹皮素（由貴州苗藥生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：DH20180712）；環(huán)磷酰胺（CTX，由山東西亞化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)，批號：ZB98974）；RPMI 1640培養(yǎng)基［由賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司生產(chǎn)］；胰蛋白酶-EDTA消化液（由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，批號：SLBT1300-100）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 H22原代細(xì)胞的培養(yǎng) 取H22細(xì)胞適量，用生理鹽水稀釋為 1×107～10×107個/ml，取 0.2 ml H22細(xì)胞皮下注射接種在小鼠右腋窩，小鼠自由成長至瘤體積大于500 mm3時，開始準(zhǔn)備剝瘤，進(jìn)行原代培養(yǎng)。采用無菌操作取出瘤體，取下瘤體組織以后，加入PBS緩沖液清洗干凈，去外周組織后用消毒剪刀剪成1～2 mm3小塊，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液研磨，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液后，加入胰酶消化2 min，終止消化，過200目的細(xì)胞篩，離心（1 000 r/min，5 min），加完全培養(yǎng)液輕輕吹散均勻制成細(xì)胞懸液。

2.2 動物分組及給藥 無菌條件下取小鼠H22原代培養(yǎng)的瘤細(xì)胞，用生理鹽水稀釋瘤細(xì)胞濃度為5×106個/ml，于小鼠右腋窩皮下接種瘤液，每只0.2 ml；接種后每日觀察小鼠接種部位腫瘤生長情況，并用游標(biāo)卡尺測量小鼠的瘤體積，瘤體積大小為500 mm3時，顯示小鼠造模成功，選出皮下瘤體積生長大小接近的荷瘤小鼠，隨機(jī)分為6組：模型對照組、環(huán)磷酰胺組、APS高劑量組、APS低劑量+環(huán)磷酰胺組、APS中劑量+環(huán)磷酰胺組、APS高劑量+環(huán)磷酰胺組，每組14只。環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺溶液灌胃，劑量為0.02 g/kg，容積為10 ml/kg；APS高劑量組予雙氫楊梅樹皮素溶液灌胃，劑量為0.60 g/kg，容積為10 ml/kg；APS低劑量+環(huán)磷酰胺組：灌胃雙氫楊梅樹皮素溶液0.15 g/kg+腹腔注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg，容積為10 ml/kg；APS中劑量+環(huán)磷酰胺組：灌胃雙氫楊梅樹皮素溶液0.30 g/kg+腹腔注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg，容積為10 ml/kg；APS高劑量+環(huán)磷酰胺組：灌胃雙氫楊梅樹皮素溶液0.60 g/kg+腹腔注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg，容積為10 ml/kg。小鼠每日給藥前稱量體重，首次給藥前先量取瘤體積即為初體積，末次給藥后量取瘤體積即為末體積，從而計(jì)算出APS聯(lián)合CTX對H22荷瘤小鼠給藥前后腫瘤體積的影響。末次給藥后24 h后頸椎脫臼處死小鼠，取血清用于生化檢測，取瘤塊、脾、胸腺和肝組織并稱取重量。

2.3 H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制率 按照公式計(jì)算各組的抑瘤率，抑瘤率（%）=（模型對照組瘤重-給藥組瘤重）/模型對照組瘤重×100%。

2.4 脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及肝臟指數(shù)的測定 末次給藥24 h后，用眼科鑷取出小鼠的脾臟、胸腺和肝臟組織，使用濾紙吸干殘血，稱重。計(jì)算各組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝臟指數(shù)。計(jì)算公式：器官指數(shù)（mg/g）=器官重量（mg）/動物體重（g）。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 APS聯(lián)合CTX對H22荷瘤小鼠腫瘤體積的影響 見表1。

表1 APS聯(lián)合CTX對H22荷瘤小鼠腫瘤體積的影響 （±s）

表1 APS聯(lián)合CTX對H22荷瘤小鼠腫瘤體積的影響 （±s）

注：與模型對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與CTX組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；下同

組 別 劑量（g/kg） 初瘤體積（mm3） 末瘤體積（mm3） 瘤體積差（mm3）模型對照組CTX組APS高劑量組APS低劑量+CTX組APS中劑量+CTX組APS高劑量+CTX組動物數(shù)開始14 14 14 14 14 14結(jié)束11 13 12 13 14 14——0.02 0.60 0.15+0.02 0.30+0.02 0.60+0.02 676.55±118.59 706.92±168.83 655.42±93.96 698.38±121.33 700.50±226.39 668.36±130.37 7 492.27±2 413.04 5 624.54±2 028.83 5 377.50±2 139.47 4 474.92±1 652.37 4 436.64±1 834.15 3 493.14±1 073.88 6 815.73±2 358.57 4 917.62±1 920.66①5 307.67±3 066.08 3 776.54±1 604.74②3 736.54±1 836.44②2 824.79±1 045.71②④

表1結(jié)果顯示，與模型對照組比較，除APS高劑量組瘤體積差變化不大外，其余用藥組瘤體積差均明顯減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與CTX組比較，APS高劑量+CTX組的瘤體積差減小更明顯，具有顯著性差異（P＜0.01）。

3.2 APS對CTX抑瘤的增效作用 見表2。

表2 APS對CTX抑瘤的增效作用 （±s）

表2 APS對CTX抑瘤的增效作用 （±s）

組 別 動物數(shù) 劑量（g/kg） 平均瘤重（g） 抑瘤率（%）模型對照組CTX組APS高劑量組APS低劑量＋CTX組APS中劑量＋CTX組APS高劑量＋CTX組開始14 14 14 14 14 14結(jié)束11 13 12 13 14 14——0.02 0.60 0.15＋0.02 0.30＋0.02 0.60＋0.02平均體重（g）開始28.99 29.85 28.06 27.63 28.30 27.76結(jié)束32.63 32.78 30.25 28.14 29.81 28.20 5.07±2.71 3.37±0.94①4.02±1.41①2.69±1.19①③2.61±0.94②③2.02±0.43②④33.57 20.72 47.07 48.52 60.26

表2結(jié)果顯示，與模型對照組比較，各用藥組瘤重均明顯減輕，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；單用藤茶雙氫楊梅樹皮素高劑量組抑瘤率為20.72%，單用CTX組抑瘤率為33.57%，藤茶雙氫楊梅樹皮素低、中、高劑量組與CTX聯(lián)用后抑瘤率分別為47.07%、48.52%和60.26%；與單用CTX組比較，聯(lián)合用藥組的平均瘤重顯著減輕，明顯提高了對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 APS對CTX抑瘤的減毒作用 見表3。

表3 APS對CTX抑瘤的減毒作用 （±s）

表3 APS對CTX抑瘤的減毒作用 （±s）

組 別 劑量（g/kg） 脾指數(shù)（mg/g） 胸腺指數(shù)（mg/g） 肝臟指數(shù)（mg/g）模型對照組CTX組APS高劑量組APS低劑量+CTX組APS中劑量+CTX組APS高劑量+CTX組動物數(shù)開始14 14 14 14 14 14結(jié)束11 13 12 13 14 14—0.02 0.60 0.15+0.02 0.30+0.02 0.60+0.02 0.70±0.32 0.37±0.13②0.65±0.23④0.47±0.15①0.49±0.17①③0.54±0.17④1.47±0.07 0.64±0.12②1.17±0.21②④1.01±0.13②④1.05±0.10②④1.34±0.08④50.33±4.82 44.14±13.73 59.23±13.26③55.32±10.62 55.54±5.47 63.61±6.50①④

表3結(jié)果顯示，與模型對照組比較，CTX組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與CTX組比較，APS中、高劑量與CTX聯(lián)合用藥后可提高小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；APS低劑量與CTX聯(lián)合用藥后可明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.01）；APS高劑量與CTX聯(lián)合用藥后還可明顯提高小鼠的肝臟指數(shù)（P＜0.01）。

4 討 論

惡性腫瘤是危及人類生命的主要疾病之一?；熞殉蔀槟[瘤綜合治理的重要手段之一，但化療藥物具有一定的毒副作用，常見的有消化障礙、骨髓障礙、臟器功能衰弱、過敏等癥狀［22］。中藥因具有較好的療效且副作用少，已受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。大部分中草藥可通過提高機(jī)體的免疫系統(tǒng)、減輕腫瘤對機(jī)體的損傷作用，從而達(dá)到增效減毒的作用。

藤茶在我國瑤族、壯族地區(qū)已有數(shù)百年的應(yīng)用歷史［23］，民間用于治療感冒、腸胃不適、肝病等，大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，藤茶的有效成分在體內(nèi)外對H22細(xì)胞［13］、S180細(xì)胞［24］、人肝癌［25］等腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡均具有明顯的抑制作用。本文通過建立H22荷瘤小鼠模型，觀察APS與常用抗癌藥物環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用的效果，并初步分析其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APS的抑瘤率低于環(huán)磷酰胺，但對脾、胸腺、肝臟指數(shù)均有增重的作用；APS聯(lián)合環(huán)磷酰胺對脾、胸腺、肝臟指數(shù)有增重作用，且抑瘤率高于單用環(huán)磷酰胺，顯示APS聯(lián)合環(huán)磷酰胺具有減毒增效作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果初步顯示，APS聯(lián)合環(huán)磷酰胺防治肝癌具有優(yōu)勢，可為中藥聯(lián)合化療藥物防治腫瘤提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？紤]到藤茶作用廣泛、機(jī)制復(fù)雜及體內(nèi)細(xì)胞因子的交互作用，其聯(lián)合增效作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究考證。