氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定嬰幼兒奶粉中37種脂肪酸和12種反式脂肪酸

田春霞，王遠(yuǎn)遠(yuǎn)，吳蘇妙，朱炳祺，金紹強(qiáng)?

(1.浙江省疾病預(yù)防控制中心，杭州 310051；2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310052；3.杭州漢庫醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，杭州 310051)

嬰幼兒是具有特殊營養(yǎng)需求的一類群體，由于其自身代謝系統(tǒng)尚未完善，營養(yǎng)的攝入要求全面均衡[1]。嬰幼兒配方奶粉的主要原料為生牛乳及精煉植物油等，其中的脂肪高達(dá)25%～31%，包括脂肪酸和極少量的反式脂肪酸(TFAs)兩類，脂肪酸包括飽和脂肪酸(SFAs)和不飽和脂肪酸(UFAs)，后者又可分為單不飽和脂肪酸(MUFAs)和多不飽和脂肪酸(PUFAs)。植物油在加工和使用過程中很容易發(fā)生氫化產(chǎn)生TFAs，而企業(yè)現(xiàn)有的工藝、設(shè)備及其使用的標(biāo)準(zhǔn)均無法有效地控制嬰兒奶粉中的TFAs含量，潛在質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)較高[2]，這給食用奶粉的嬰兒帶來了負(fù)面的健康影響[3]。有研究表明，長(zhǎng)期食用含有TFAs的奶粉，不僅會(huì)干擾嬰幼兒對(duì)必需脂肪酸的吸收，還會(huì)造成嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙[4-5]。因此，國際食品法典委員會(huì)(CAC)對(duì)嬰幼兒配方食品中的TFAs含量的限定規(guī)定為不超過總脂肪酸的3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；從2010年起，中國對(duì)嬰兒配方食品也作出了同樣的規(guī)定[1，3，6]。

目前關(guān)于食品中脂肪酸和TFAs的檢測(cè)方法有很多，主要包括光譜法、色譜法及銀離子薄層色譜法等[7]。光譜法包括紅外光譜法(近紅外、中紅外光譜)和拉曼光譜法，光譜法檢測(cè)反式脂肪酸簡(jiǎn)便快速，對(duì)樣品無損傷，但只能獲得TFAs的總含量，無法獲得單個(gè)TFA 的含量[8-12]，且TFAs在脂肪中的含量遠(yuǎn)低于脂肪酸，在檢測(cè)時(shí)易受脂肪酸的干擾。色譜法包括液相色譜法[13-15]和氣相色譜法[16-18]。液相色譜法一般需要先采用衍生試劑對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后再利用熒光或者紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，該方法響應(yīng)靈敏度不高，存在一定的應(yīng)用局限性[19]。氣相色譜法靈敏度高，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，已被國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.168－2016 和GB 5009.257－2016 采用。然而，嬰幼兒奶粉中脂肪酸組成復(fù)雜，且標(biāo)準(zhǔn)品有限，國家標(biāo)準(zhǔn)選用的氣相色譜法僅靠保留時(shí)間定性，很難通過色譜分離和質(zhì)譜定性對(duì)一些未知色譜峰進(jìn)行判斷。氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物的定性定量分析，其在反式脂肪酸檢測(cè)上的應(yīng)用開始被越來越多的人所關(guān)注[20]。

由于脂肪酸和反式脂肪酸的檢測(cè)原理一致，本工作基于將脂肪酸先轉(zhuǎn)化為沸點(diǎn)較低且易于氣化的脂肪酸甲酯，根據(jù)其在極性毛細(xì)管色譜柱的保留規(guī)律建立了GC-MS 測(cè)定嬰幼兒奶粉中脂肪酸及TFAs含量的方法，以期為嬰幼兒奶粉中脂肪酸和TFAs的測(cè)定方法做出有益探索。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B-7000C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配7693自動(dòng)進(jìn)樣器；Multifuge型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；RV 10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及真空泵；METER XPE 205型電子天平；SW 23型恒溫振蕩水浴箱。

12 種反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:5.00 g·L－1，分別稱取反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品各100.0 mg，用異辛烷溶解并定容至10.0 mL，在(－18±4)℃下保存。

37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:10 g·L－1，介質(zhì)為異辛烷。

反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液:0.2 g·L－1，吸取反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，用異辛烷定容，在(－18±4)℃下保存。

脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液:0.5 g·L－1，吸取37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL 于20 mL容量瓶中，用異辛烷定容，在(－18±4)℃下保存。

2 mol·L－1氫氧化鉀-甲醇溶液:取13.1 g氫氧化鉀溶解在100 mL甲醇中，可輕微加熱，加入無水硫酸鈉干燥，過濾，得到澄清溶液。

60 g·L－1碳酸鈉溶液:稱取6 g無水碳酸鈉，用水溶解并定容至100.0 mL。

反-9-十六碳烯酸甲酯(C16:1 9t)、反-6-十八碳烯酸甲酯(C18:1 6t)、反-9-十八碳烯酸甲酯(C18:1 9t)、反-11-十八碳烯酸甲酯(C18:1 11t)、反亞油酸甲酯(C18:2 9t，12t)、反-10-順-12-十八碳二烯酸甲酯(C18:2 10t，12c)、反-13-二十二碳烯酸甲酯(C22:1 13t)、反-11-二十碳烯酸甲酯(C20:1 11t)等8種反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于99%；4種亞麻酸甲酯順反異構(gòu)體(反式脂肪酸甲酯)混合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為10 g·L－1[其種類和含量比例為:C18:3 9t，12t，15t(30%)；C18:3 9t，12t，15c＋C18:3 9t，12c，15t＋C18:3 9c，12t，15t(45%)；C18:3 9c，12c，15t＋C18:3 9c，12t，15c＋C18:3 9t，12c，15c(21%)，C18:3 9c，12c，15c(4%)]；3種不同品牌配方奶粉均購自超市；95%乙醇、鹽酸、氨水、乙醚、石油醚、異辛烷、甲醇、氫氧化鉀、硫酸氫鈉、正己烷、乙酰氯、無水碳酸鈉等試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 HP-88毛細(xì)管色譜柱(100 m×0.25 mm，0.25μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；溶劑延遲11.5 min；載氣為高純氦氣(純度不小于99.999%)；分流比10∶1；流量1 mL·min－1；進(jìn)樣量1.0μL。色譜柱升溫程序:初始溫度為130 ℃，保持5 min；然后以2 ℃·min－1的速率升溫至220 ℃，保持8 min；再以2 ℃·min－1速率升溫至240 ℃，保持10 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 e V；離子源溫度230℃；接口溫度220℃；全掃描范圍m/z45～450。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取5.0 g 奶粉置于錐形瓶中，加入乙醇2 mL和水4 mL，混勻，再加入氨水20 mL，混勻，放在75 ℃的恒溫振蕩水浴中水解40 min。每5 min振蕩錐形瓶，將黏在瓶壁的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出錐形瓶冷卻至室溫，加入乙醇10 mL，混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，用體積比為1∶1的乙醚-石油醚混合液30 mL 沖洗錐形瓶，沖洗液也倒入離心管中，加蓋。在低溫?fù)u床中振搖10 min，然后以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液收集至100 mL燒瓶中。按照以上步驟重復(fù)提取2次，合并醚層提取液并用旋轉(zhuǎn)濃縮至干，殘留物為脂肪提取物。稱取脂肪提取物樣品60.0 mg至離心管中，加入異辛烷4 mL溶解樣品，再加入2 mol·L－1氫氧化鉀-甲醇溶液200μL，加蓋后振搖30 s后靜置至澄清。加入約1 g硫酸氫鈉中和氫氧化鉀，以3 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心3 min，將上清液移至進(jìn)樣瓶中，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱

由于嬰幼兒配方奶粉中的乳脂、植物油、魚油、藻油等均為脂肪來源，脂肪酸構(gòu)成復(fù)雜，因此需要采用高極性色譜柱進(jìn)行分離。本工作考察了SP-2560和HP-88毛細(xì)管色譜柱的分離效果，當(dāng)采用SP-2560毛細(xì)管色譜時(shí)，順-13-二十二碳烯酸甲酯(C22:1n9)和順-11，14，17-二十碳三烯酸甲酯(C20:3n3)不能分離，只出現(xiàn)一個(gè)峰。采用HP-88毛細(xì)管色譜柱，結(jié)果顯示以上兩種物質(zhì)達(dá)到基線分離且峰形良好。因此，試驗(yàn)選用HP-88毛細(xì)管色譜柱。

2.1.2 色譜柱升溫程序

升溫程序會(huì)對(duì)脂肪酸的分離產(chǎn)生影響。試驗(yàn)考察了兩種不同的升溫程序:①試驗(yàn)方法中升溫程序；②初始溫度為130 ℃，保持5 min；以1 ℃·min－1速率升溫至220 ℃，保持8 min；以1 ℃·min－1速率升溫至240 ℃，保持10 min。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用第二種方法進(jìn)行分離時(shí)，因升溫速率過慢，目標(biāo)物出峰時(shí)間延長(zhǎng)，峰寬變大，峰形變差。試驗(yàn)選擇試驗(yàn)方法中的升溫程序。

按照優(yōu)化后的色譜條件對(duì)脂肪酸和反式脂肪酸進(jìn)行測(cè)定，由于檢測(cè)反式脂肪酸時(shí)，很容易受脂肪酸的干擾，因此對(duì)12種反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，有利于對(duì)樣品進(jìn)行比較和檢索，色譜圖見圖1。在實(shí)際分析中，由于奶粉中脂肪酸種類較少，對(duì)奶粉中的脂肪酸和TFAs進(jìn)行同時(shí)測(cè)定時(shí)，即使部分譜峰發(fā)生重合，也可通過定性離子和質(zhì)譜庫檢索進(jìn)行區(qū)分。

由圖1可知:大部分脂肪酸甲酯的分離效果都很好；只有部分反式脂肪酸甲酯，如C18:3 9t，12t，15c和C18:3 9t，12c，15t、C18:3 9c，12t，15t 和C18:3 9c，12c，15t、C18:3 9c，12t，15c和C18:3 9t，12c，15c的分離效果不夠理想，但可滿足日常檢測(cè)的要求。

2.2 脂肪提取方法的選擇

試驗(yàn)分別考察了采用酸水解法、堿水解法、酸堿水解法對(duì)脂肪提取率的影響。酸水解法、堿水解法和酸堿水解法脂肪的提取率分別為16.89%，19.14%，15.21%，堿水解法的提取率較高，和GB 5009.168－2016中的脂肪提取方法一致。因此，試驗(yàn)采用堿水解法。

2.3 甲酯化方法的選擇

本工作分別采用氫氧化鉀-甲醇法和乙酰氯-甲醇甲酯化法對(duì)奶粉進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1和表2。

由表1和表2 可知:這兩種方法測(cè)得的SFAs含量相似；乙酰氯-甲醇甲酯化法測(cè)得的PUFAs含量是氫氧化鉀-甲醇法的2.0倍；氫氧化鉀-甲醇法測(cè)得的UFAs 的含量是乙酰氯-甲醇甲酯化法的1.5倍；氫氧化鉀-甲醇法測(cè)得的TFAs總含量與乙酰氯-甲醇甲酯化法相近，但氫氧化鉀-甲醇法測(cè)得的TFAs種類更多，能提供更多的信息，綜合考慮，試驗(yàn)選用氫氧化鉀-甲醇法作為甲酯化方法。

2.4 定量方法和檢出限

奶粉中脂肪酸含量的定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和面積歸一化法。對(duì)于同系物含量的測(cè)定，面積歸一化法更簡(jiǎn)便。因此，采用面積歸一化法測(cè)定脂肪酸的含量。

由于TFAs含量比較低，儀器靈敏度不夠，極易被脂肪酸掩蓋，本工作對(duì)TFAs進(jìn)行了外標(biāo)法驗(yàn)證。以正己烷將反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液逐級(jí)稀釋成5，10，20，50，100，200 mg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，然后在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。以12種反式脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

以3倍信噪比計(jì)算反式脂肪酸甲酯的檢出限(3S/N)，結(jié)果見表3。

2.5 精密度及回收試驗(yàn)

在嬰幼兒奶粉樣品中加入C16:1 9t、C18:2 9t，12t、C22:1 13t標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)(n＝5)，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，見表4。

由表4 可知:3 種物質(zhì)的回收率為75.5%～107%，RSD 為1.1%～8.5%，方法準(zhǔn)確可靠，基本能滿足實(shí)際測(cè)定需要。

2.6 樣品分析

根據(jù)試驗(yàn)方法對(duì)3種市售嬰幼兒奶粉(分別標(biāo)記為奶粉-1、奶粉-2、奶粉-3)進(jìn)行測(cè)定，不同脂肪酸和TFAs測(cè)定結(jié)果見表5。

圖1 脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solutions of fatty acid methyl ester and trans-fatty acid methyl ester

表1 不同甲酯化方法測(cè)得的奶粉中的脂肪酸甲酯含量Tab.1 Content of fatty acid methyl ester in milk powder determined by the different methylation methods

表1 (續(xù))

表2 不同甲酯化方法測(cè)得的奶粉中的反式脂肪酸甲酯含量Tab.2 Content of trans-fatty acid methyl esters in milk powder determined by the different methylation methods

由表5 可知:奶粉中SFAs 的含量最高，為53.9%～58.3%；TFAs的含量均小于0.5%，小于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最高含量(3%)；有兩種奶粉中并未檢出芥酸(對(duì)應(yīng)C22:1)，另一種奶粉檢測(cè)出的芥酸含量小于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的1%。3 種奶粉中，月桂酸(對(duì)應(yīng)C12:1)和肉豆蔻酸(對(duì)應(yīng)C14:0)含量最高為15.81%，最低為13.03%，均小于國家 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(20%)。3 種奶粉中所測(cè)得的花生四烯酸(對(duì)應(yīng)C20:4)含量最高為0.31%，二十二碳六烯酸(對(duì)應(yīng)C22:6n3)含量最高為0.23%，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

表3 反式脂肪酸甲酯的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(n＝6)Tab.3 Linear ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits of trans-fatty acid methyl esters(n＝6)

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

表5 3種奶粉中脂肪酸和TFAs的含量Tab.5 Content of the fatty acids and TFAs in the 3 milk powders

本工作建立的方法簡(jiǎn)單快捷，可以滿足奶粉中脂肪酸和TFAs的日常檢測(cè)，為奶粉中脂肪酸的營養(yǎng)安全研究工作提供支持，同時(shí)對(duì)其他樣品中脂肪酸和TFAs的同時(shí)檢測(cè)提供參考。