• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    尖吻蝮蛇毒抑瘤組分I通過PERK/eIF2α通路誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究*

    2020-07-06 03:55:36王振杰張根葆
    中國病理生理雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:蛇毒貨號鱗癌

    王振杰,柴 琳,徐 冉,張根葆,3

    (皖南醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室,2口腔醫(yī)學(xué)院,3蛇毒蛇傷研究所,安徽蕪湖241001)

    口腔鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,多數(shù)為舌鱗癌[1-2]。舌部血運(yùn)豐富導(dǎo)致舌鱗癌細(xì)胞生長快,浸潤性強(qiáng),易轉(zhuǎn)移[3]。雖然舌鱗癌的治療方法在不斷發(fā)展,但患者的5年生存率僅為55%左右[4],且各種治療方法都有不同程度的不良反應(yīng)。因此,尋求一種安全、高效、廉價(jià)的治療方式對舌鱗癌患者具有重要的意義。

    蛇毒為我國豐富的天然藥用資源,具有降壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓、抗腫瘤等作用[5],其中的抗腫瘤作用仍是目前研究的熱點(diǎn)。尖吻蝮蛇毒抑瘤組分I(anti-tumor component I fromAgkistrodon acutusvenom,AAVC-I)是由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒蛇傷研究所利用蛋白分離純化技術(shù)從皖南尖吻蝮蛇毒中提取的一種活性成分[6],對肺癌、白血病等[7-10]多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用。但AAVC-I具體是如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡目前尚未完全明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是近些年發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)立于死亡受體和線粒體途徑的新凋亡通路[11-12],而其中的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/真核翻譯起始因子 2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)通路最為關(guān)鍵。因此,本實(shí)驗(yàn)基于ERS相關(guān)的PERK/eIF2α通路探討AAVC-I對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞凋亡的影響,為尋找蛇毒抗腫瘤作用靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材料和方法

    1 細(xì)胞

    人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞于2014年10月購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,由皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室凍存保留。

    2 主要藥品試劑

    胎牛血清(廣州鴻泉生物科技有限公司,批號:180809);DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco,批號:8118392);0.25%胰蛋白酶溶液(批號:J150003)和PBS(批號:NAG1434)購自 HyClone;AAVC-I(皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒蛇傷研究所提供);MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(編號:C0009)、HE染色試劑盒(編號:C0105)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型,編號:P0010S)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;4%組織細(xì)胞固定液(合肥睿捷生物科技有限公司,批號:7J21BL014);annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物科技有限公司,批號:BB19061);RIPA組織/細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司,批號:20180809);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒(編號:BL522A)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白上樣緩沖液(5×,編號:BL502A)和聚偏二氟乙烯膜(編號:BSPVDF-45)均購自 BioSharp;PageRuler? Prestained Protein Ladder(ThermoFisher,批號:00505780);Ⅰ抗[葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)兔單克隆抗體(貨號:3177T)、p-PERK兔單克隆抗體(貨號:3179S)、p-eIF2α兔單克隆抗體(貨號:3398T)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)兔單克隆抗體(貨號:11815S)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein,CHOP)兔單克隆抗體(貨號:5554T)、Bax兔單克隆抗體(貨號:5023T)、Bcl-2兔單克隆抗體(貨號:4223T)和GAPDH兔單克隆抗體,貨號:4970T)]和Ⅱ抗(辣根過氧物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,貨號:7074P2)均購自 Cell Signaling Technology;ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore,批號 :1722101)。

    3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

    CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher,型號:311);酶標(biāo)儀(Tecan Austria GmbH,型號:Sunrise);流式細(xì)胞儀(BD,型號:FACSVerse);電泳和轉(zhuǎn)模系統(tǒng)(Bio-Rad,型號:PowerPacTMBasic);凝膠成像儀(Bio-Rad,型號:Universal Hood II)。

    4 實(shí)驗(yàn)方法

    4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在5%CO2、37℃恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    4.2 MTT法檢測AAVC-I對Tca8113細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞,經(jīng)胰蛋白酶消化離心去上清后,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/L。按每孔200 μL細(xì)胞懸液的量均勻接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,然后將其于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后,去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液,加入100 μL含10%胎牛血清和不同濃度(2.0、4.0、8.0、16.0和24.0 mg/L)AAVC-I的DMEM高糖培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)置空白對照(blank control)組和正常對照(normal control)組,每組各6個(gè)復(fù)孔,將其繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后向每孔內(nèi)加入10 μL濃度為5 g/L的MTT,再于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。4 h后再向每孔內(nèi)加入100 μL的formazan溶解液,適當(dāng)混勻。最后在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育至formazan全部溶解,于酶標(biāo)儀570 nm波長測定每孔吸光度(A)并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(inhibitory rate,IR)。公式如下:IR(%)=[1-(藥物濃度組平均A值-空白對照組平均A值)/(正常對照組平均A值-空白對照組平均A值)]×100%。

    4.3 HE染色觀察AAVC-I對Tca8113細(xì)胞形態(tài)的影響 收集對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/L。按每孔3 mL細(xì)胞懸液的量將細(xì)胞均勻接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后,去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液,每孔加入3 mL含10%胎牛血清和不同濃度AAVC-I的DMEM高糖培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)置正常對照組;繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板,吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,用PBS液輕輕清洗每孔2遍,加入4%組織細(xì)胞固定液2 mL固定細(xì)胞30 min;去除固定液,用PBS清洗每孔2遍,加入1 mL蘇木素染液染色5 min;吸去蘇木素染液并用單蒸水流水沖洗每孔2 min;向每孔加入1 mL伊紅染液染色1 min;單蒸水流水沖洗每孔1 min;最后于倒置顯微鏡下鏡檢拍照。

    4.4 annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡 密度為2×107/L的對數(shù)生長期Tca8113細(xì)胞懸液按每孔3 mL接種到6孔板中。培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液并加入實(shí)驗(yàn)濃度的AAVC-I,每孔3 mL,同時(shí)設(shè)置正常對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h;收集每孔上清液中的細(xì)胞和胰酶消化的貼壁細(xì)胞于相對應(yīng)10 mL離心管中,4℃、500×g離心5 min,棄上清;用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀,再4℃、300×g離心5 min,棄上清液,每支離心管加入400 μL的annexin V結(jié)合液(1×)重懸細(xì)胞;每支離心管加入5 μL的FITC染色液,輕輕混勻,于4℃避光條件下孵育15 min;每支離心管再加入10 μL的PI染色液,輕輕混勻,于4℃避光條件下孵育5 min;最后用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,使用FlowJo 10.0.7軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

    4.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)量 取密度為2×107/L的對數(shù)生長期Tca8113細(xì)胞懸液按每孔3 mL接種到6孔板中。24 h細(xì)胞貼壁后去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液并加入實(shí)驗(yàn)濃度的AAVC-I,每孔3 mL,同時(shí)設(shè)置正常對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h;吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液加入冷PBS液輕輕清洗每孔2遍,清洗后再向每孔加入RIPA細(xì)胞裂解液(含1%的PMSF)200 μL;把6孔板置于冰上輕輕刮下孔內(nèi)細(xì)胞使其與細(xì)胞裂解液充分接觸。待細(xì)胞充分裂解后收集孔內(nèi)總蛋白液于1.5 mL離心管內(nèi),4℃、12 000×g離心5 min;收集離心管內(nèi)總蛋白上清液于新的1.5 mL離心管內(nèi),并用BCA法測定總蛋白濃度,然后加入相應(yīng)量的5×蛋白上樣緩沖液,沸水中煮10 min使蛋白充分變性。取相同質(zhì)量變性后的總蛋白液行SDS-PAGE分離;然后把凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上;轉(zhuǎn)膜后用5%的牛血清白蛋白室溫下對膜進(jìn)行封閉1.5 h;對封閉完成的膜于4℃搖床上孵育Ⅰ抗過夜,Ⅰ抗孵育結(jié)束后用TBST液洗膜3次(每次5 min);加入Ⅱ抗室溫孵育1 h,Ⅱ抗孵育結(jié)束后再次用TBST洗膜3次(每次5 min);在膜上滴加化學(xué)發(fā)光劑于凝膠成像儀上曝光顯影;最后利用圖像分析軟件Image Lab 5.2.1對條帶進(jìn)行分析。

    5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著性差異t檢驗(yàn)(LSD-t),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞活力的抑制作用

    不同濃度的AAVC-I處理Tca8113細(xì)胞24 h,MTT法檢測結(jié)果顯示,隨著AAVC-I濃度(2.0、4.0、8.0、16.0和24.0 mg/L)的增加,細(xì)胞抑制率逐漸升高,AAVC-I各濃度組與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。AAVC-I處理Tca8113細(xì)胞24 h的IC50為17.69 mg/L(圖1),故選擇4.0、8.0和16.0 mg/L作為AAVC-I的實(shí)驗(yàn)濃度。

    2 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞形態(tài)的影響

    實(shí)驗(yàn)濃度的AAVC-I作用Tca8113細(xì)胞24 h,對細(xì)胞進(jìn)行HE染色可以明顯觀察到細(xì)胞的形態(tài)變化。正常對照組細(xì)胞的胞核經(jīng)蘇木素染成藍(lán)紫色,胞質(zhì)經(jīng)伊紅染成粉紅色,細(xì)胞飽滿呈良好的貼壁生長狀態(tài),形態(tài)多為梭形或不規(guī)則多邊形;隨著AAVC-I實(shí)驗(yàn)濃度的增加,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞逐漸皺縮變小,細(xì)胞間隙增大,其中AAVC-I(16 mg/L)組大部分細(xì)胞胞膜消失,僅看到染色加深呈固縮狀態(tài)的胞核,并且出現(xiàn)大量的細(xì)胞碎片和凋亡小體,見圖2。

    表1 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞活力的影響Table 1.Inhibitory effect of AAVC-I on viability of Tca8113 cells(Mean±SD.n=6)

    Figure 1.Inhibitory effect of AAVC-I on viability of Tca8113 cells.圖1 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞活力的影響

    Figure 2.Effects of AAVC-I on morphological changes of Tca8113 cells(HE staining).圖2 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞形態(tài)的影響

    3 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞凋亡的影響

    實(shí)驗(yàn)濃度的AAVC-I處理Tca8113細(xì)胞24 h后,用annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,正常對照組細(xì)胞凋亡率為(2.27±0.36)%,AAVC-I(4.0 mg/L)組凋亡率為(11.04±2.03)%,AAVC-I(8.0 mg/L)組凋亡率為(18.71±0.71)%,AAVC-I(16.0 mg/L)組凋亡率為(35.50±2.26)%,AAVC-I各濃度組的細(xì)胞凋亡率較正常對照組顯著升高(P<0.05),且各濃度組的細(xì)胞凋亡率之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    4 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    實(shí)驗(yàn)濃度的AAVC-I處理Tca8113細(xì)胞24 h后,Western blot法檢測了ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK/eIF2α通路中的p-PERK和p-eIF2α、PERK/eIF2α通路下游的ATF4和CHOP,以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與對照組相比,AAVC-I各濃度組 GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP和Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05),且AAVC-I各濃度組的蛋白表達(dá)水平之間的差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4~6。

    討 論

    臨床治療腫瘤以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為有效策略之一[13],其中,細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)是一種評價(jià)和篩選抗腫瘤藥物快捷有效的方法[14]。ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是近年來抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)[15]。研究表明,ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路是促進(jìn)人白血病細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞凋亡的有效途徑[16-18]。本實(shí)驗(yàn)室基于ERS相關(guān)的PERK/eIF2α信號通路,進(jìn)一步研究AAVC-I促人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

    Figure 3.Effect of AAVC-I on apoptosis of Tca8113 cells.The apoptosis of the Tca8113 cells treated with AAVC-I for 24 h was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal control group;#P<0.05 vs AAVC-I(4.0 mg/L)group;△P<0.05 vs AAVC-I(8.0 mg/L)group.圖3 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞凋亡的影響

    Figure 4.The protein levels of GRP78,p-PERK and p-eIF2α in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal control group;#P<0.05 vs AAVC-I(4.0 mg/L)group;△P<0.05 vs AAVC-I(8.0 mg/L)group.圖4 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞GRP78、p-PERK和p-eIF2α蛋白水平的影響

    Figure 5.The protein expression levels of ATF4 and CHOP in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal control group;#P<0.05 vs AAVC-I(4.0 mg/L)group;△P<0.05 vs AAVC-I(8.0 mg/L)group.圖5 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞ATF4和CHOP蛋白表達(dá)水平的影響

    Figure 6.The protein expression levels of Bax and Bcl-2 in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal control group;#P<0.05 vs AAVC-I(4.0 mg/L)group;△P<0.05 vs AAVC-I(8.0 mg/L)group.圖6 AAVC-I對Tca8113細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

    本實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用MTT法檢測不同濃度的AAVCI對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞活力的抑制作用。結(jié)果顯示,在AAVC-I處理Tca8113細(xì)胞24 h后,隨著濃度的增加,AAVC-I對細(xì)胞活力的抑制作用逐漸增強(qiáng);另外,根據(jù)IC50值確定AAVC-I的合適實(shí)驗(yàn)濃度,繼續(xù)作用細(xì)胞24 h,HE染色結(jié)果可以直接觀察到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。在AAVC-I作用肺癌、白血病等[7-10]腫瘤細(xì)胞的既往研究表明,AAVC-I在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)也誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,與本文結(jié)果一致,且本實(shí)驗(yàn)采用annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡水平的結(jié)果進(jìn)一步顯示了AAVC-I誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡的作用呈劑量依賴性。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)胞凋亡主要是由于抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的平衡失衡而導(dǎo)致的,其中Bcl-2蛋白家族在當(dāng)中起著重要作用[19-21]。我們應(yīng)用Western blot檢測顯示,在AAVC-I誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低。有研究證實(shí),在ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中,過表達(dá)的CHOP蛋白會(huì)引起B(yǎng)cl-2蛋白家族的失衡而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,隨著AAVC-I濃度的增加,細(xì)胞凋亡率逐漸上升,CHOP蛋白的表達(dá)水平也隨之升高。在這一過程中,當(dāng)AAVC-I誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),我們又進(jìn)一步檢測了ERS標(biāo)志性蛋白GRP78的表達(dá)量,結(jié)果顯示其表達(dá)水平亦升高。有研究發(fā)現(xiàn),ERS標(biāo)志性蛋白GRP78在細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)表達(dá)量顯著增加,進(jìn)而減緩ERS對細(xì)胞的損傷,同時(shí)GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK解離,導(dǎo)致PERK蛋白激活自身磷酸化,磷酸化的PERK會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致eIF2α蛋白磷酸化以抑制蛋白質(zhì)的合成,從而減少錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集,有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[24-25]。本實(shí)驗(yàn)同樣觀察到AAVC-I各濃度組的磷酸化PERK和磷酸化eIF2α蛋白水平均高于正常對照組,同時(shí)ATF4蛋白水平也升高。ATF4蛋白是ERS相關(guān)的PERK/eIF2α通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子,持續(xù)ERS時(shí)磷酸化的eIF2α蛋白會(huì)導(dǎo)致ATF4蛋白合成大量增加并與CHOP基因啟動(dòng)子結(jié)合使CHOP蛋白大量表達(dá),最終引起細(xì)胞凋亡[26-27]。國內(nèi)外研究表明,敲除CHOP基因和在缺氧條件下發(fā)生的ERS中沉默PERK基因,均可顯著抑制細(xì)胞凋亡[28-29]。這進(jìn)一步佐證了本研究的結(jié)果。

    在之前的蛇毒抗腫瘤研究中,我們只是針對蛇毒抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行簡單研究分析[7-10],而本實(shí)驗(yàn)在蛇毒抗腫瘤效應(yīng)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制,表明AAVC-I在誘導(dǎo)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞凋亡時(shí)ERS相關(guān)的PERK/eIF2α通路發(fā)揮著重要作用,這為蛇毒抗腫瘤的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但還需注意的是,由于蛇毒成分復(fù)雜,純化技術(shù)難度大,蛇毒促腫瘤細(xì)胞凋亡的ERS相關(guān)PERK/eIF2α通路機(jī)制是否與其它促凋亡機(jī)制之間存在聯(lián)系等問題還有待深入研究。

    同時(shí),細(xì)胞系作為體外模型而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。不同細(xì)胞系之間可能存在交叉污染,其中最為常見的是多種細(xì)胞系受到HeLa細(xì)胞污染[30-32],而本研究中所用到的人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞也不能排除受到HeLa細(xì)胞的污染[33],但本教研室對蛇毒抗多種腫瘤細(xì)胞的大量研究證實(shí),蛇毒抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的作用是值得肯定的。

    猜你喜歡
    蛇毒貨號鱗癌
    蛇毒組學(xué)與抗毒素組學(xué):蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在抗蛇毒血清效價(jià)評估中的應(yīng)用
    惡性胸膜間皮瘤、肺鱗癌重復(fù)癌一例
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    蛇血蛇膽蛇毒引病來
    注射蛇毒卻不死的人
    基于深度學(xué)習(xí)的宮頸鱗癌和腺鱗癌的識別分類
    作者更正致歉說明
    整合素αvβ6和JunB在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
    肛瘺相關(guān)性鱗癌1例
    大學(xué)生網(wǎng)球裝備推薦
    亚洲第一区二区三区不卡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 青青草视频在线视频观看| 男人操女人黄网站| av.在线天堂| 久久久欧美国产精品| 免费看av在线观看网站| 9191精品国产免费久久| 中文字幕色久视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99国产综合亚洲精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 两性夫妻黄色片| 亚洲中文av在线| 国产乱人偷精品视频| 亚洲四区av| 成人漫画全彩无遮挡| 操美女的视频在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品一二三| 亚洲专区中文字幕在线 | videos熟女内射| 嫩草影院入口| 操出白浆在线播放| 99九九在线精品视频| 高清不卡的av网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 婷婷色av中文字幕| 在线观看国产h片| 亚洲av男天堂| 少妇被粗大猛烈的视频| 制服丝袜香蕉在线| 五月开心婷婷网| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 婷婷色av中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99久久综合免费| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费高清在线观看日韩| 欧美激情 高清一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 久久久久久人人人人人| 国产精品国产三级国产专区5o| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久影院123| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲国产av影院在线观看| 免费观看a级毛片全部| 亚洲国产精品999| 99久久人妻综合| 亚洲熟女毛片儿| 最近的中文字幕免费完整| 国产在视频线精品| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品女同一区二区软件| 久久综合国产亚洲精品| 国产男女内射视频| 国产麻豆69| 男女下面插进去视频免费观看| 九草在线视频观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 成年动漫av网址| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 欧美在线一区亚洲| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成年人免费黄色播放视频| 国产毛片在线视频| 777米奇影视久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人精品在线电影| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| videos熟女内射| 国产野战对白在线观看| 丁香六月天网| 涩涩av久久男人的天堂| 999久久久国产精品视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品国产综合久久久| 免费观看性生交大片5| 91老司机精品| 男女国产视频网站| 日韩av免费高清视频| 亚洲综合色网址| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 9热在线视频观看99| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品卡一卡二卡四卡免费| 多毛熟女@视频| 各种免费的搞黄视频| 少妇人妻 视频| 日韩精品有码人妻一区| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩av在线免费看完整版不卡| 90打野战视频偷拍视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日日啪夜夜爽| 老汉色∧v一级毛片| 韩国高清视频一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 亚洲欧美激情在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 少妇人妻 视频| 男女边摸边吃奶| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产探花极品一区二区| 男女床上黄色一级片免费看| 人妻 亚洲 视频| 涩涩av久久男人的天堂| 精品人妻一区二区三区麻豆| 天堂俺去俺来也www色官网| 老司机亚洲免费影院| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 美国免费a级毛片| 五月天丁香电影| 欧美日韩av久久| 久久人人爽人人片av| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲三区欧美一区| 另类精品久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久久人人人人人| 免费黄频网站在线观看国产| 国产成人系列免费观看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲男人天堂网一区| 男女床上黄色一级片免费看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产免费现黄频在线看| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 91精品伊人久久大香线蕉| 国产99久久九九免费精品| 丁香六月欧美| 午夜福利视频精品| 好男人视频免费观看在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 超碰成人久久| 亚洲熟女毛片儿| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产av一区二区精品久久| 免费看不卡的av| 久久久久精品人妻al黑| 看十八女毛片水多多多| 国产av精品麻豆| 久久久国产精品麻豆| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 午夜福利一区二区在线看| 美女午夜性视频免费| 国产精品国产av在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲中文av在线| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费观看人在逋| 最新的欧美精品一区二区| 男女下面插进去视频免费观看| 免费看av在线观看网站| 青春草国产在线视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久人人97超碰香蕉20202| 日韩电影二区| 亚洲第一青青草原| 女性生殖器流出的白浆| av.在线天堂| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av免费观看日本| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲av男天堂| 国产男女内射视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 高清欧美精品videossex| 久久久久精品性色| 亚洲五月色婷婷综合| 中文字幕亚洲精品专区| 伊人久久国产一区二区| 国产色婷婷99| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 最新的欧美精品一区二区| 日日撸夜夜添| 久久久精品94久久精品| 亚洲色图综合在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 999精品在线视频| 亚洲第一av免费看| 国产伦理片在线播放av一区| 90打野战视频偷拍视频| 成人毛片60女人毛片免费| 69精品国产乱码久久久| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久久久精品精品| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久狼人影院| 亚洲成色77777| 欧美精品一区二区大全| 少妇人妻 视频| 欧美另类一区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 大片免费播放器 马上看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产乱人偷精品视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲国产av新网站| √禁漫天堂资源中文www| 嫩草影院入口| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲精品国产区一区二| 精品亚洲成国产av| 国产成人一区二区在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 青草久久国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲色图综合在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 悠悠久久av| 免费黄频网站在线观看国产| 两个人免费观看高清视频| 亚洲成色77777| 黄频高清免费视频| 亚洲天堂av无毛| 国产精品三级大全| 午夜日韩欧美国产| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久久久人妻| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲,欧美,日韩| 老司机影院毛片| 街头女战士在线观看网站| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲久久久国产精品| 欧美xxⅹ黑人| 免费在线观看黄色视频的| 夫妻午夜视频| 午夜91福利影院| 国产精品久久久久久久久免| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产免费现黄频在线看| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲免费av在线视频| 黑人猛操日本美女一级片| 丰满少妇做爰视频| 晚上一个人看的免费电影| 少妇被粗大的猛进出69影院| 看十八女毛片水多多多| 麻豆av在线久日| 亚洲免费av在线视频| 国产精品女同一区二区软件| 欧美日韩av久久| 亚洲精品一区蜜桃| 国产在线视频一区二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜老司机福利片| 国产人伦9x9x在线观看| 热re99久久国产66热| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 捣出白浆h1v1| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一级毛片 在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 色94色欧美一区二区| 只有这里有精品99| 色网站视频免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品欧美亚洲77777| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲欧美色中文字幕在线| videosex国产| 久久久久精品久久久久真实原创| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲四区av| 日本91视频免费播放| 午夜福利在线免费观看网站| 国产极品天堂在线| 成年女人毛片免费观看观看9 | 成年人午夜在线观看视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲在久久综合| 日韩av不卡免费在线播放| 女人精品久久久久毛片| 午夜日韩欧美国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美激情 高清一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 日韩欧美一区视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 日本色播在线视频| 9色porny在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 中文字幕人妻丝袜制服| 极品人妻少妇av视频| 久久 成人 亚洲| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久狼人影院| 天堂中文最新版在线下载| 国产麻豆69| 中文字幕av电影在线播放| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美国产精品一级二级三级| 2021少妇久久久久久久久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美最新免费一区二区三区| 男人操女人黄网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产 精品1| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色网站视频免费| 日日撸夜夜添| 日日摸夜夜添夜夜爱| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线天堂中文资源库| 青草久久国产| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品一区二区在线观看99| 日本色播在线视频| 91老司机精品| 国产日韩欧美视频二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 男女免费视频国产| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 免费看不卡的av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本欧美视频一区| 亚洲av电影在线进入| 99热网站在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 韩国精品一区二区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 日日撸夜夜添| a级毛片黄视频| a级片在线免费高清观看视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 黄片播放在线免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产一区二区激情短视频 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 超碰97精品在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美日韩福利视频一区二区| av在线播放精品| 亚洲精品一区蜜桃| 男女免费视频国产| 成人影院久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 婷婷色综合大香蕉| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费观看av网站的网址| 国产精品 欧美亚洲| 妹子高潮喷水视频| 日本黄色日本黄色录像| 又大又黄又爽视频免费| 国产在视频线精品| 国产又色又爽无遮挡免| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品久久久久成人av| 另类亚洲欧美激情| 午夜日本视频在线| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩伦理黄色片| av国产久精品久网站免费入址| 午夜福利视频在线观看免费| 交换朋友夫妻互换小说| 天堂8中文在线网| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费观看av网站的网址| www.精华液| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 中国三级夫妇交换| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| av电影中文网址| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品一国产av| 亚洲成人手机| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品,欧美精品| 热re99久久国产66热| 精品一区二区三卡| 黄片无遮挡物在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久精品免费免费高清| 制服诱惑二区| 午夜91福利影院| 人妻 亚洲 视频| 制服诱惑二区| 丰满少妇做爰视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产麻豆69| 欧美日韩精品网址| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲成国产人片在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲国产日韩一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 九色亚洲精品在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 一本色道久久久久久精品综合| 国产一级毛片在线| 久久99一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 观看av在线不卡| 五月天丁香电影| 久久久国产精品麻豆| www.熟女人妻精品国产| av线在线观看网站| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人91sexporn| 欧美成人午夜精品| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 91成人精品电影| 国产精品一国产av| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产欧美亚洲国产| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 老熟女久久久| 两性夫妻黄色片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 视频区图区小说| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 男女免费视频国产| 高清不卡的av网站| 精品一品国产午夜福利视频| 精品国产一区二区久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 免费看不卡的av| 国产精品亚洲av一区麻豆 | av在线观看视频网站免费| 超碰成人久久| 亚洲av电影在线进入| 精品第一国产精品| 秋霞伦理黄片| 日日撸夜夜添| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲精品视频女| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 五月开心婷婷网| 久久综合国产亚洲精品| 国产成人系列免费观看| 免费观看a级毛片全部| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 国产99久久九九免费精品| 国产av一区二区精品久久| 色吧在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 国产黄色免费在线视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲中文av在线| 在线观看国产h片| 久久狼人影院| 亚洲免费av在线视频| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男的添女的下面高潮视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品酒店卫生间| 中国国产av一级| 日韩欧美一区视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 男人爽女人下面视频在线观看| 天天添夜夜摸| 午夜免费鲁丝| 国产不卡av网站在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产av精品麻豆| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产又色又爽无遮挡免| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产不卡av网站在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲精品一区蜜桃| 操出白浆在线播放| 婷婷色av中文字幕| 超色免费av| 国产日韩欧美视频二区| 国产成人精品久久二区二区91 | 老司机靠b影院| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 99国产综合亚洲精品| 99久久综合免费| 成人免费观看视频高清| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品一品国产午夜福利视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 三上悠亚av全集在线观看| 日本午夜av视频| 国产一级毛片在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一级黄片播放器| 电影成人av| 水蜜桃什么品种好| 国产精品 国内视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产在线免费精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费在线观看完整版高清| 亚洲国产精品一区三区| 宅男免费午夜| 久久热在线av| 高清视频免费观看一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产一卡二卡三卡精品 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 免费高清在线观看日韩| 国产1区2区3区精品| 女性生殖器流出的白浆| 久久97久久精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产99久久九九免费精品| 十八禁网站网址无遮挡| 中文字幕av电影在线播放| 久久久国产精品麻豆| 丝袜美足系列| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品少妇内射三级| 亚洲成人av在线免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲成人手机| 天天添夜夜摸| 又黄又粗又硬又大视频| 国产熟女欧美一区二区| 老司机深夜福利视频在线观看 | 日韩欧美精品免费久久| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成人精品久久久久久| 老司机深夜福利视频在线观看 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美精品一区二区免费开放| 超碰97精品在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 精品国产乱码久久久久久男人| 国产在视频线精品| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 飞空精品影院首页| 人人妻人人澡人人看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 狂野欧美激情性xxxx| 国产淫语在线视频| 激情五月婷婷亚洲| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久久久久久久免费视频了| 国产一区二区三区综合在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品日本国产第一区| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久久免费高清国产稀缺| 又大又黄又爽视频免费| 午夜福利视频在线观看免费| 国产激情久久老熟女| 18禁国产床啪视频网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产成人精品在线电影|