舌下含服免疫治療對效應性T 細胞和調節(jié)性T 細胞功能的影響

戴 飛，魏瑾瑾，湯欣玥，陳 崢，藺 林

復旦大學附屬華山醫(yī)院北院耳鼻咽喉頭頸外科，上海201907

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）對世界10%～40%的人口造成影響，降低其生活質量，損傷其勞動能力，加重家庭和社會的經(jīng)濟負擔[1]。藥物治療，包括口服或局部用抗組胺藥、鼻用激素、局部用色甘酸鈉或白三烯受體拮抗劑，并不能改變AR 的自然發(fā)病進程，而且會帶來不良反應[2]。免疫治療，無論是皮下免疫治療（subcutaneous immunotherapy，SCIT）還是舌下含服免疫治療（sublingual immunotherapy，SLIT），不僅能使患者脫敏從而緩解臨床癥狀，還能維持長期療效[3]。尤其是SLIT，不但更安全，而且患者耐受性更好[4]，但該治療方式的作用機制目前尚不十分清楚。

本研究旨在探討SLIT 對AR 炎癥反應中效應性T 細胞（effector T cell，Teff）和調節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）功能的影響及其可能的機制。

1 對象與方法

1.1 病例資料

選擇2016 年1 月—2018 年12 月復旦大學附屬華山醫(yī)院北院耳鼻咽喉頭頸外科招募的20 例AR 患者完成研究。診斷標準：①依據(jù)《變應性鼻炎及其對哮喘的影響（ARIA）指南（2016 年修訂版）》[Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma （ARIA） guidelines-2016 revision][1]及《 變應性鼻炎診斷和治療指南（2015 年，天津）》[5]的建議，具有相應的臨床癥狀和體征。②變應原皮膚點刺試驗（skin prick test，SPT）陽性（其標準為皮膚表面風團面積＞ 7 mm2或直徑＞3 mm，使用德國默克集團Allergopharma公司的阿羅格點刺液）。③變應原血清特異性IgE 檢測陽性（≥0.35 kU/L，使用德國EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG 公司試劑盒）。本研究納入符合上述診斷標準且只對粉塵螨和屋塵螨存在過敏的上海地區(qū)AR患者，年齡18 ～75 歲，性別不限。排除伴有下列情況的上海地區(qū)AR 患者：對粉塵螨過敏原檢測陰性，間歇性或持續(xù)性中-重度哮喘，長期使用口服抗組胺藥治療，近1個月之內使用過全身激素治療，伴慢性阻塞性肺部疾病，伴嚴重心臟病、肝硬化、尿毒癥，有激素使用禁忌證，對甘油過敏，處于妊娠期的AR 女性患者，伴惡性腫瘤，符合粉塵滿滴劑禁忌證患者，近3 個月內參加過其他臨床試驗者。本研究得到復旦大學附屬華山醫(yī)院倫理委員會的批準（編號：2016-312），所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 干預方法

按照廠家的規(guī)定劑量，采用粉塵螨滴劑（浙江我武生物科技股份有限公司）進行干預。其中粉塵螨滴劑1 號濃度為1 μg/mL，粉塵螨滴劑2 號濃度為10 μg/mL，粉塵螨滴劑3 號濃度為100 μg/mL，粉塵螨滴劑4 號濃度為333 μg/mL，粉塵螨滴劑5 號濃度為1 000 μg/mL；裝量均為2 mL。

1.3 外周血單個核細胞的獲取

分別在治療前及治療24 個月和30 個月時獲取AR 患者的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），一部分用于檢測Teff 和Treg 所占CD4+T 細胞百分比及2 種細胞中鈣釋放激活鈣通道調節(jié)分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）蛋白的濃度和Ca2+平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），一部分用于體外培養(yǎng)的相關試驗。

1.4 流式細胞儀檢測

所獲PBMC 經(jīng)過離心（200×g）10 min 處理后，將細胞濃度調整至5×105個/mL，用CD4、CD25 和CD127單克隆抗體以及叉頭框蛋白3（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）染色試劑盒（均購于美國MyBioSource）分離并鑒定Teff（CD4+CD25-CD127high） 和Treg（CD4+CD25+Foxp3+CD127low），并用流式細胞儀相關軟件FlowJo 對Teff 和Treg所占CD4+T 細胞百分比進行分析；向上述濃度細胞懸液中加入Fluo-3 Ca2+熒光探針（5 μmol/L）（美國Abcam）以檢測Teff 和Treg 中游離Ca2+濃度（以Ca2+MFI 代表其濃度），所得數(shù)據(jù)用Becton Dickinson CellQuest 軟件進行分析。

1.5 ELISA 檢測

將細胞懸液離心，加入RIPA 裂解液，用ORAI1 ELISA 試 劑 盒（美 國MyBioSource）檢 測Teff 和Treg 中ORAI1 的含量；同樣，用白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）和IL-10 ELISA 試劑盒（均購于美國MyBioSource）對培養(yǎng)基上清中的細胞因子IL-4 和IL-10 的濃度進行檢測。

1.6 細胞培養(yǎng)

將從PBMC 中分離的Teff 和Treg 分別進行體外培養(yǎng)，將2 種細胞濃度調整至5×105個/mL，移入T 細胞培養(yǎng)液（含有RPMI-1640、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、50 μmol/L β-巰基乙醇和100 U/mL IL-2），并加入30 μg/mL 粉塵螨滴劑，體外培養(yǎng)7 d，然后進行后續(xù)檢測。

1.7 免疫熒光檢測

將Teff 和Treg 爬片48 h，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）清洗，然后以4%多聚甲醛在室溫下固定，用含有0.2% Triton X-100 的PBS 溶液（PBS-T）洗滌，3%牛血清白蛋白封閉30 min，再將樣品與ORAI1單克隆抗體（美國MyBioSource，MBS150032）在室溫下孵育過夜，PBS 清洗，然后與結合了異硫氰基熒光素（fluorescein isothiocyante，F(xiàn)ITC）的抗體在室溫下避光孵育1 h，洗滌后以濃度為10 mg/mL 的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在室溫下進行細胞核染色5 min，最后用防熒光淬滅劑封片，用激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司，型號TCSSP5）檢測，并以LCS（Leica confocal software）Lite 軟件分析。

1.8 含人ORAI1 短發(fā)夾RNA 的慢病毒的制備及轉染

含人ORAI1 短發(fā)夾RNA （short hairpin RNA，shRNA）的慢病毒（lentivirus，lenti）的制備、鑒定和轉染均由上海漢恒生物科技有限公司完成。首先根據(jù)ORAI1 基因的轉錄本設計小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）靶點，合成引物（上游引物5'-TTTGCCCTCATGATCAGCAC-3'， 下游引物5'-TTGGCGACGATGACTGATTC-3'）。將單鏈的引物退火成雙鏈oligo 序列，連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體（含有ZsGreen1 綠色熒光蛋白標簽），將轉化子進行測序驗證，然后把測序驗證正確的克隆進行高純度質粒抽提；接著在293T 細胞中包裝慢病毒，包裝完成后即形成帶有ORAI1 shRNA 的lenti（lenti-ORAI1）。按照感染復數(shù)=10，將濃度為1×109TU/mL 的lenti-ORAI1 加入Teff 和Treg 培養(yǎng)基進行轉染。轉染1 周后收集細胞以Western blotting 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-IR-R304）進行ORAI1 蛋白表達水平檢測，以 β-肌動蛋白（β-actin）作為內參，使用ORAI1 單克隆抗體（美國MyBioSource，MBS150032）進行抗原抗體反應。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6 軟件進行統(tǒng)計學分析。所得數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗呈正態(tài)分布，用±s 表示。組內、組間差異的比較采用配對t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PBMC 中Teff 和Treg 所占CD4+ T 細胞百分比的變化

在治療前及治療24 個月和30 個月時獲取AR 患者的PBMC，用流式細胞儀檢測其中Teff 和Treg 所占CD4+T 細胞百分比。根據(jù)相關研究[6]，Teff 細胞表面標志為CD4+CD25-CD127high，Treg 為CD4+CD25+Foxp3+CD127low。結果顯示，治療24 個月時Teff 所占CD4+T 細胞百分比顯著少于治療前（即0 個月時）（P=0.000），而治療30 個月時Teff 所占百分比又顯著少于治療24 個月時（P=0.027）（圖1A、B）；但Treg變化情況正好相反，治療24 個月時Treg 所占CD4+T 細胞百分比顯著多于治療前（P=0.000），而治療30 個月時Treg 所占百分比又顯著多于治療24 個月時（P=0.008）（圖1C、D）。

圖1 治療24 個月和30 個月時PBMC 中Teff 和Treg 的流式細胞檢測及其占CD4+ T 細胞百分比的變化 Fig 1 Flow cytometry analysis of Teff and Treg in PBMC and changes of percentages of them in CD4+ T cells 24 and 30 months after treatment

2.2 Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白表達和Ca2+ MFI 的變化

ORAI1 蛋白對T 細胞的各種功能有著至關重要的作用[7]，因此本研究分析SLIT 是否能夠影響T 細胞亞群Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白的表達。ELISA 檢測結果顯示，治療24 個月時Teff 中ORAI1 蛋白的表達顯著少于治療前（P=0.000），而治療30 個月時Teff 中的表達又顯著少于治療24 個月時（P=0.003）（圖2A）；但Treg 中的變化情況相反，治療24 個月時Treg 中ORAI1 蛋白的表達顯著多于治療前（P=0.000），而治療30 個月時ORAI1 蛋白的表達又顯著多于治療24 個月時（P=0.007）（圖2B）。

ORAI1 蛋白的功能是促進細胞外Ca2+的內流，從而影響細胞的各種活動[8]，因此我們又對Teff 和Treg 中Ca2+MFI 的變化進行了分析。結果表明，Ca2+MFI 的變化與ORAI1 蛋白的表達趨勢基本一致，治療24 個月時Teff 中Ca2+MFI 顯著少于治療前（P=0.000），而治療30 個月時Teff 中Ca2+MFI 又顯著少于治療24 個月時（P=0.000）（圖2C）；但Treg 中的變化情況相反，治療24 個月時Treg 中Ca2+MFI 顯著多于治療前（P=0.000），而治療30 個月時Ca2+MFI 又顯著多于治療24 個月時（P=0.000）（圖2D）。

圖2 治療24 個月和30 個月時Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白表達和Ca2+ MFI 的變化 Fig 2 Changes of ORAI1 protein expression and Ca2+ MFI in Teff and Treg 24 and 30 months after treatment

2.3 體外培養(yǎng)的Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白的表達

為了進一步確定體外培養(yǎng)的Teff 和Treg 中是否有ORAI1蛋白的表達，以決定是否可以進行下一步的功能試驗，對SLIT 30 個月時的2 種細胞進行了免疫熒光染色和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測，結果發(fā)現(xiàn)2 種細胞均有ORAI1 蛋白的表達，其熒光表現(xiàn)為綠色，該蛋白主要位于細胞膜表面（圖3）。

圖3 體外培養(yǎng)的Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白的表達（×200）Fig 3 Expression of ORAI1 protein in Teff and Treg cultured in vitro (×200)

2.4 Lenti-ORAI1 轉染對細胞中Ca2+MFI 和培養(yǎng)基中IL-4和IL-10 濃度的影響

為了確定lenti-ORAI1 是否可以轉染至Teff 和Treg中，用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)SLIT 30 個月時的2 種細胞熒光均表現(xiàn)為綠色，Western blotting 檢測顯示轉染后的蛋白表達條帶減弱，說明成功轉染了目的序列（圖4）。接著對Teff 和Treg 中游離Ca2+的濃度進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，lenti-ORAI1 轉染后，Teff 中Ca2+MFI 顯著下降（P=0.004）（圖5A），Treg 中Ca2+MFI 也顯著下降（P=0.000）（圖5B）。此外，lenti-ORAI1 轉染后，Teff細胞培養(yǎng)基中IL-4 濃度減少（P=0.009）（圖5C），Treg細胞培養(yǎng)基中IL-10 濃度也減少（P=0.000）（圖5D）。

圖4 Lenti-ORAI1 轉染效率驗證Fig 4 Validation of transfection efficiency of lenti-ORAI1

3 討論

免疫治療的機制包括輔助型T 細胞2（T helper 2 cell，Th2）型免疫反應的抑制、Th1 型免疫反應的上調[9]、CD4+IL-4+T 細胞的凋亡[10]、IL-10+CD4+CD25+T 細胞的增殖[11]和封閉抗體的產(chǎn)生[12]等，但就該治療方法是否影響T 細胞中ORAI1 蛋白的功能及細胞中游離Ca2+的濃度尚鮮有報道。

先前研究[13]發(fā)現(xiàn)ORAI1 位于免疫系統(tǒng)細胞膜表面，后來的研究[14]表明，該分子及其相關通道也存在于其他類型細胞膜。ORAI1 相關通道是一種細胞質中內質網(wǎng)鈣儲備調控性Ca2+通道[15]，它的激活可以促使細胞外Ca2+大量內流[16]，上調細胞質內游離Ca2+濃度，從而促進各種細胞功能的實施，如增殖分化、細胞脫顆粒以及細胞因子的合成和分泌等[17]。這種通道由ORAI1 及其變構體ORAI2、ORAI3 組成，其中ORAI1 的變異和缺失對其功能影響較大[7]。研究[18]證實，ORAI1 蛋白可以通過促進T 細胞外游離Ca2+的內流，從而升高T 細胞內游離Ca2+濃度，進一步上調T 細胞內Ca2+信號通路，最終促進T 細胞的增殖、合成和分泌細胞因子等功能。

圖5 Lenti-ORAI1 轉染對細胞中Ca2+ MFI 和培養(yǎng)基中IL-4 和IL-10 濃度的影響Fig 5 Influence of lenti-ORAI1 transfection on Ca2+ MFI in cells and concentration of IL-4 and IL-10 in cell cultures

本研究即是以T 細胞亞群Teff 和Treg 中的ORAI1 蛋白為切入點，探討SLIT 是否可以通過調控上述2 種細胞中ORAI1 蛋白的表達量來影響其功能，從而影響AR 的炎癥狀態(tài)。結果表明，治療24 個月時AR 患者PBMC 中Teff 所占CD4+T 細胞百分比顯著少于治療前，而治療30個月時Teff 所占百分比又顯著少于治療24 個月時，說明隨著治療時間的延長，Teff 的增殖在持續(xù)減弱；另外，Treg 在治療24 個月時所占CD4+T 細胞百分比顯著多于治療前，而治療30 個月時Treg 所占百分比又顯著多于治療24 個月時，說明治療時間越長，Treg 的增殖就越多。該結果說明，SLIT 可以減少促進AR 炎癥反應的Teff 在血液中的數(shù)量，增加抑制炎癥反應的Treg 的數(shù)量，從而緩解AR 患者的炎癥狀態(tài)。隨后，又就SLIT 對Teff 和Treg 中的ORAI1 蛋白的表達進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，治療24 個月時Teff 中該蛋白的表達顯著少于治療前，而治療30 個月時Teff 中該蛋白的表達又顯著少于治療24 個月時，這說明免疫治療抑制了Teff 細胞中ORAI1 的表達；對Treg 也進行了相關研究，發(fā)現(xiàn)治療24 個月時Treg中ORAI1 蛋白的表達顯著多于治療前，而治療30 個月時ORAI1 蛋白的表達又顯著多于治療24 個月時，說明免疫治療上調了Treg 的ORAI1 的表達。

為了說明ORAI1 蛋白的功能是否受到了影響，接著對2種細胞中游離Ca2+濃度進行了檢測。結果顯示，Ca2+MFI 的變化與ORAI1 分子在這2 種細胞中的表達趨勢基本類似，治療24 個月時Teff 中Ca2+MFI 顯著少于治療前，而治療30 個月時Teff 中Ca2+MFI 又顯著少于治療24 個月時；但Treg 治療24 個月時細胞中Ca2+MFI 顯著多于治療前，而治療30個月時Ca2+MFI 又顯著多于治療24 個月時。該結果顯示，SLIT 可以降低Teff 中ORAI1 蛋白的表達及細胞中游離Ca2+濃度以削弱其促進炎癥作用，同時也可以升高Treg 中ORAI1蛋白的表達和細胞中游離Ca2+濃度來增強其抑制炎癥作用。

以上研究結果顯示SLIT 可對Teff 和Treg 中ORAI1及Ca2+MFI 產(chǎn)生影響，但就這2 種細胞中ORAI1 的表達水平變化是否會影響其細胞內Ca2+濃度變化及隨后的功能改變尚待進一步證實。因此又將Teff 和Treg 分別進行體外培養(yǎng)，并用免疫熒光技術進行檢測，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的這2 種細胞表面均表達ORAI1 蛋白，接著用預先設計并制備好的lenti-ORAI1 感染Teff 和Treg。結果提示，lenti-ORAI1 有效地抑制了2 種細胞的ORAI1 蛋白表達，并導致Teff 和Treg 中Ca2+MFI 濃度降低。接著又分別對這2種細胞培養(yǎng)基上清液中的細胞因子IL-4 和IL-10 進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其濃度也顯著減少，這說明ORAI1 蛋白的表達降低導致了Teff 分泌IL-4 和Treg 分泌IL-10 的功能減弱。進一步證明了SLIT 對Teff 和Treg 中ORAI1 的表達及Ca2+MFI 產(chǎn)生的影響，最終導致了2 種細胞功能的改變。IL-4 主要由肥大細胞和Th 細胞合成和釋放，該細胞因子可以誘導B 細胞的生長、發(fā)育，并促進B 細胞產(chǎn)生和分泌IgE；同時，IL-4 也可以誘導Th 細胞向Th2 細胞的分化，因此IL-4 在AR 的發(fā)病機制中起著重要的作用[19]。IL-10 主要由Treg 產(chǎn)生和釋放，該細胞因子可以抑制Th 細胞的增殖和Th2 細胞分泌Ⅱ型細胞因子（如IL-4、IL-5 和IL-13 等），從而抑制AR 的炎癥反應[20]。本研究中，Teff 的ORAI1 表達減少，細胞功能減弱，提示其促進炎癥的功能也減退；而Treg 的ORAI1 表達增多，細胞功能相應增強，提示其抑制炎癥的能力在增強。因此，本研究提示，SLIT 不僅可以抑制Teff 增殖，同時促進Treg增殖，也可以通過上調Treg 中ORAI1 蛋白的表達或下調Teff 中ORAI1 蛋白的表達來調控變應性炎癥的嚴重程度。

總之，本研究表明，SLIT 后AR 患者PBMC 中Teff所占CD4+T 細胞百分比逐漸減少，而Treg 逐漸增多；Teff 中ORAI1 蛋白和Ca2+的濃度也逐漸減少，而Treg 中逐漸增多；體外培養(yǎng)的這2 種細胞均表達ORAI1 蛋白，而且在lenti-ORAI1 轉染后，2 種細胞中Ca2+MFI 和培養(yǎng)基中IL-4 和IL-10 的濃度均降低。上述結果顯示SLIT 可以通過調節(jié)ORAI1 蛋白的表達而控制Teff 和Treg 細胞的功能。但是SLIT 的治療機制還有很多方面尚未闡明[21]，仍需要進一步研究。

參·考·文·獻

[1] Bro?ek JL, Bousquet J, Agache I, et al. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA) guidelines-2016 revision[J]. J Allergy Clin Immunol, 2017, 140(4): 950-958.

[2] Greiner AN, Hellings PW, Rotiroti G, et al. Allergic rhinitis[J]. Lancet, 2011, 378(9809): 2112-2122.

[3] Jutel M, Agache I, Bonini S, et al. International Consensus on Allergen Immunotherapy Ⅱ: mechanisms, standardization, and pharmacoeconomics[J]. J Allergy Clin Immunol, 2016, 137(2): 358-368.

[4] Canonica GW, Cox L, Pawankar R, et al. Sublingual immunotherapy: World Allergy Organization position paper 2013 update[J]. World Allergy Organ J, 2014, 7(1): 6.

[5] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會鼻科組, 中華醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會鼻科學組. 變應性鼻炎診斷和治療指南（2015 年，天津）[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2016, 51(1): 6-24.

[6] O'Hehir RE, Gardner LM, de Leon MP, et al. House dust mite sublingual immunotherapy: the role for transforming growth factor-β and functional regulatory T cells[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2009, 180(10): 936-947.

[7] Feske S, Gwack Y, Prakriya M, et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function[J]. Nature, 2006, 441(7090): 179-185.

[8] Feske S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease[J]. Nat Rev Immunol, 2007, 7(9): 690-702.

[9] Ebner C, Siemann U, Bohle B, et al. Immunological changes during specific immunotherapy of grass pollen allergy: reduced lymphoproliferative responses to allergen and shift from TH2to TH1in T-cell clones specific for Phl p 1, a major grass pollen allergen[J]. Clin Exp Allergy, 1997, 27(9): 1007-1015.

[10] Gardner LM, O'Hehir RE, Rolland JM. High dose allergen stimulation of T cells from house dust mite-allergic subjects induces expansion of IFN-γ+T cells, apoptosis of CD4+IL-4+T cells and T cell anergy[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2004, 133(1): 1-13.

[11] Francis JN, Till SJ, Durham SR. Induction of IL-10+CD4+CD25+T cells by grass pollen immunotherapy[J]. J Allergy Clin Immunol, 2003, 111(6): 1255-1261.

[12] Wachholz PA, Durham SR. Induction of ‘blocking’ IgG antibodies during immunotherapy[J]. Clin Exp Allergy, 2003, 33(9): 1171-1174.

[13] Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4(7): 517-529.

[14] Lin L, Zheng CQ, Zhang LP, et al. Up-regulation of Orai1 in murine allergic rhinitis[J]. Histochem Cell Biol, 2010, 134(1): 93-102.

[15] Parekh AB, Putney JW Jr. Store-operated calcium channels[J]. Physiol Rev, 2005, 85(2): 757-810.

[16] Peinelt C, Vig M, Koomoa DL, et al. Amplification of CRAC current by STIM1 and CRACM1 (Orai1)[J]. Nat Cell Biol, 2006, 8(7): 771-773.

[17] Mercer JC, Dehaven WI, Smyth JT, et al. Large store-operated calcium selective currents due to co-expression of Orai1 or Orai2 with the intracellular calcium sensor, Stim1[J]. J Biol Chem, 2006, 281(34): 24979-24990.

[18] Gwack Y, Feske S, Srikanth S, et al. Signalling to transcription: store operated Ca2+entry and NFAT activation in lymphocytes[J]. Cell Calcium, 2007, 42(2): 145-156.

[19] Okano M, Satoskar AR, Abe M, et al. Interleukin-4-independent production of Th2 cytokines by nasal lymphocytes and nasal eosinophilia in murine allergic rhinitis[J]. Allergy, 2000, 55(8): 723-731.

[20] Shamji MH, Durham SR. Mechanisms of allergen immunotherapy for inhaled allergens and predictive biomarkers[J]. J Allergy Clin Immunol, 2017, 140(6): 1485-1498.

[21] O'Hehir RE, Sandrini A, Anderson GP, et al. Sublingual allergen immunotherapy: immunological mechanisms and prospects for refined vaccine preparation[J]. Curr Med Chem, 2007, 14(21): 2235-2244.