線粒體Lon 蛋白酶及其相關(guān)疾病的研究進展

楊碩瑤 ，戚紫怡，向 軍

1. 上海交通大學(xué)仁濟臨床醫(yī)學(xué)院，上海200127；2. 上海-渥太華聯(lián)合醫(yī)學(xué)院，上海 200127；3. 上海交通大學(xué)瑞金臨床醫(yī)學(xué)院，上海 200025；4. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷整形科，上海 200025

Lon 蛋白酶（Lon protease，LON）是一種依賴ATP的絲氨酸蛋白酶，亦是與多種細(xì)胞活動相關(guān)的ATPase 蛋白家族成員之一，具有絲氨酸-賴氨酸催化結(jié)構(gòu)，能夠在降解折疊錯誤及損傷蛋白質(zhì)、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。20 世紀(jì)80 年代細(xì)菌及酵母菌中的LON 被發(fā)現(xiàn)，而后人類LON 的基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也于1993 年被揭示[1]。隨著對LON 結(jié)構(gòu)與功能的深入了解發(fā)現(xiàn)，LON 在退行性疾病、衰老及機體缺血缺氧進程中均存在異常表達(dá)，而通過酶抑制劑、基因調(diào)控等或可對LON 進行定向干預(yù)，從而延長患者壽命以及提高其生活質(zhì)量。本文就LON 及其與疾病關(guān)系的研究進展進行綜述。

1 LON 的結(jié)構(gòu)及存在部位

LON 在細(xì)菌、酵母菌及哺乳動物體內(nèi)均存在同源蛋白質(zhì)，進化過程中高度保守，具有顯著的進化保護作用。細(xì)菌LON 也稱蛋白酶La，酵母LON 也稱Pim-1[2]。目前，已知的人類LON 有2 種，即線粒體LON（LONP1）和過氧化物酶體LON（LONP2），其中相關(guān)研究多聚焦于前者。LONP1 由核基因LONP1 編碼而成，該基因位于19 號染色體p13.2。翻譯出來的LONP1 的N 端帶有線粒體靶向序列（mitochondrial targeting sequence，MTS），可引導(dǎo)其進入線粒體，而后MTS 被剪切形成成熟的LONP1。LONP1 由956 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約100 000；從N 端到C端共包括3 個功能區(qū)，依次為底物識別區(qū)、ATP 酶區(qū)和蛋白水解區(qū)。研究[3]發(fā)現(xiàn)，90%的LONP1 以可溶形式存在于線粒體基質(zhì)中，10%則存在于線粒體內(nèi)膜。LONP1 常以六聚體的形式存在，形成中空的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠特異性地將底物包裹，催化蛋白質(zhì)水解，而當(dāng)以單體形式存在時則無蛋白酶活性[4]。LONP1 廣泛存在于各種細(xì)胞，在肝臟、腦、心臟、骨骼肌和胎盤組織中高度表達(dá)，而在腎臟、肺、胰腺和免疫器官也有一定的表達(dá)[2]。與LONP1 相似，LONP2 由852 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約95 000。LONP2 的基因位于16 號染色體，經(jīng)翻譯后可通過其C 端的過氧化物酶體定位信號（peroxisomal targeting signal 1，PTS1）靶向過氧化物酶體基質(zhì)，且該蛋白酶同樣含有3 個功能區(qū)[5]。LONP2 在人的胰腺、腎臟和肝臟組織中高表達(dá)。與LONP1 不同，LONP2 的保守性相對有限[6]。

2 Lon 的功能

在細(xì)胞的新陳代謝中，蛋白質(zhì)的合成和降解是一個動態(tài)平衡的過程，即不斷有新的蛋白質(zhì)合成，同時又有結(jié)構(gòu)受損或功能喪失的蛋白質(zhì)被清除，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在胞質(zhì)及胞核中，承擔(dān)蛋白質(zhì)的降解以及回收利用的主要執(zhí)行者是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。而在線粒體中，承擔(dān)此功能的就是LON。有文獻(xiàn)[4]表明LONP1 在線粒體中發(fā)揮了重要的“清道夫”功能，其可選擇性地降解異常蛋白質(zhì)，如折疊錯誤、突變的蛋白質(zhì)，以及某些壽命短暫的調(diào)控蛋白質(zhì)，對維持線粒體及細(xì)胞的功能具有重要意義。同樣，LONP2 在過氧化物酶體中也承載了相似的功能[5]。

線粒體是細(xì)胞重要的“能量工廠”，同時還參與細(xì)胞的信息傳遞、分化及凋亡等過程，并可調(diào)控細(xì)胞生長及細(xì)胞周期。LONP1 作為線粒體內(nèi)的“多面手”，是線粒體代謝和自由基損傷反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，包括蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制和線粒體功能的維護。目前LONP1 在細(xì)胞內(nèi)的功能尚未被詳盡闡釋，但已知其至少存在3 種不同的作用，具體介紹如下。

2.1 蛋白酶功能

越來越多的研究[7]發(fā)現(xiàn)，作為水解受損蛋白質(zhì)的蛋白酶和特定的線粒體酶，LONP1 的作用底物較為廣泛，包括特異和非特異2 種。其中，特異底物包括烏頭酸酶、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A， TFAM）、類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）、細(xì)胞色素c 氧化酶4 亞型1 （cytochrome c oxidase 4 isoform 1，CcO4-1）、胱硫醚β 合酶、谷氨酰胺酶C、氨甲?；D(zhuǎn)移酶（ornithine transcarbamylase，OTC）等。烏頭酸酶是催化檸檬酸和異檸檬酸相互轉(zhuǎn)化的酶，在三羧酸循環(huán)中具有重要作用，常作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。TFAM 能夠直接調(diào)控哺乳動物的線粒體DNA 拷貝數(shù)，而LONP1 可通過控制TFAM 的降解來實現(xiàn)對DNA拷貝數(shù)的調(diào)控。StAR 是腎上腺皮質(zhì)和性腺中類固醇激素產(chǎn)生所需的激素生成急性調(diào)節(jié)蛋白，可介導(dǎo)膽固醇進入線粒體內(nèi)膜，從而在線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為類固醇[8]。LON 參與StAR 水解，后者可通過作用于核呼吸因子2（nuclear respiratory factor 2，NRF-2）通路刺激其轉(zhuǎn)錄，形成一個調(diào)控環(huán)[9]。CcO 是細(xì)胞呼吸電子傳遞鏈末端的酶，具有質(zhì)子泵的作用，可將H+由基質(zhì)抽提到膜間隙，同時還可通過血紅素中鐵原子的氧化還原變化，把電子傳遞給氧形成水，在ATP 的產(chǎn)生過程中具有重要作用。此外，CcO也參與了機體的氧化應(yīng)激過程[10]。在非耐藥腫瘤細(xì)胞中CcO4-1 的水平有所降低，在耐藥腫瘤細(xì)胞中CcO 的活性明顯增強，而在帕金森病等神經(jīng)退行性疾病中CcO 活性是下調(diào)的[11]。因此，LONP1 通過水解調(diào)控上述蛋白，對生命過程產(chǎn)生重要影響。

2.2 線粒體DNA 的結(jié)合蛋白

LONP1 能夠結(jié)合線粒體DNA 中重要蛋白質(zhì)基因的啟動子序列，如線粒體酶、解旋酶、TFBM、TFAM 等，影響這些蛋白的表達(dá)水平，間接參與調(diào)節(jié)線粒體DNA 復(fù)制和有絲分裂。

2.3 蛋白伴侶

采用免疫共沉淀技術(shù)對LONP1 進行研究發(fā)現(xiàn)，其可與76 種不同的線粒體蛋白結(jié)合，如熱休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）、肌球蛋白9/10、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、原鈣黏蛋白18 等[12]。其中，LONP1 可通過與Hsp60 相互作用來維持HSP60 的穩(wěn)定，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，從而在惡劣環(huán)境下保護細(xì)胞。

3 LON 的表達(dá)和調(diào)控

諸多轉(zhuǎn)錄因子可能參與了LON 基因的表達(dá)調(diào)控。LONP1 的一個啟動子區(qū)是-623/+1，包含1 個NRF-2結(jié)合位點，且NRF-2 是活性氧反應(yīng)因子，可通過調(diào)控LONP1 的表達(dá)促進線粒體DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[13]。另一個非常重要的啟動子區(qū)是-2023/-1230，包含核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）結(jié)合位點，該位點的存在進一步證明了LONP1 能夠參與細(xì)胞應(yīng)激及腫瘤形成過程。低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）也能顯著誘導(dǎo) LONP1 的表達(dá)，已發(fā)現(xiàn)LONP1 啟動子包含5 個 潛在HIF-1 結(jié)合位點。染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）實 驗 證 實HIF-1α 和HIF-2α 均可與LONP1 相結(jié)合[14]。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）是參與腫瘤轉(zhuǎn)化的主要因子之一，而線粒體穩(wěn)態(tài)的破壞則是腫瘤的重要特征。研究[15]發(fā)現(xiàn)，EGF 能夠?qū)ONP1 的表達(dá)進行調(diào)控，該過程由2 個重要的致癌途徑介導(dǎo)，即胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK） 途 徑 和 磷 酸 肌 醇3- 激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K） 途 徑。 此 外，LONP1 的表達(dá)也受到翻譯后的多種調(diào)控。定位在線粒體的去乙?；?（sirtuin 3，SIRT3）可介導(dǎo)LONP1 去乙?；?，而沉默SIRT3 可導(dǎo)致LON 水平及其乙?；骄兴?，但并不會影響mRNA 的表達(dá)水平[16]。

4 LON 的異常表達(dá)與相關(guān)疾病

4.1 LON 基因突變

LONP1 基因突變導(dǎo)致其蛋白與ATP 結(jié)合發(fā)生異常，從而不能有效利用ATP。臨床研究[17]發(fā)現(xiàn)，LONP1 突變可直接導(dǎo)致人腦、眼、牙、耳、骨（足）異常，簡稱CODAS綜 合 征（cerebral，ocular，dental，auricular and skeletal anomalies syndrome）。CODAS 綜合征是一種罕見的先天性疾病，表現(xiàn)為多系統(tǒng)發(fā)育異常，其臨床特征多樣，包括典型線粒體遺傳病的癥狀如智力障礙、殘疾、身材矮小、聽力喪失、視力下降、肌張力低下、上瞼下垂和運動遲緩等，也包括CODAS 綜合征特有的骨骼和牙齒異常等癥狀。CODAS 綜合征的發(fā)現(xiàn)為LONP1 功能喪失而危害機體健康提供了證據(jù)。在針對小鼠的一項研究[18]發(fā)現(xiàn)，Lonp1-/-小鼠在胚胎期即發(fā)生死亡；而Lonp1+/-小鼠則發(fā)育正常，但其組織中LONP1 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平下降了一半。因此該研究進一步證實，LONP1 是機體生存所必需的。

4.2 LON 表達(dá)下調(diào)

多項研究表明，LON 表達(dá)下調(diào)與衰老密切相關(guān)。Hoshino 等[19]針對老年大鼠、年輕大鼠肌組織中LON 表達(dá)水平進行研究發(fā)現(xiàn)前者為后者的25%；雖然隨年齡的增加，鍛煉和熱量攝入限制會抑制LON 表達(dá)下降，但老年大鼠Lon 的可誘導(dǎo)性則出現(xiàn)了大幅度降低或完全喪失。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)在不同組織中LON 表達(dá)水平隨年齡的變化存在一定差異，即老年大鼠肝臟中LON 表達(dá)水平無明顯變化、LON 活性降低到40%，而老年大鼠心臟中其蛋白水平是年輕大鼠的5 倍、總活性保持不變，推測LON 表達(dá)水平的增加是單位質(zhì)量酶活性下降的補償。因此，該研究證實在衰老過程中機體將伴隨LON 功能不足。一般認(rèn)為，急性應(yīng)激原如熱休克、血清饑餓、氧化應(yīng)激等可導(dǎo)致LONP1 在較長時間內(nèi)表達(dá)上調(diào)，并伴隨異常蛋白清除增加及細(xì)胞生存率升高[20]。然而，慢性和嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)如廣泛的缺氧或長期的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致LONP1 表達(dá)下調(diào)，在老化的細(xì)胞中均出現(xiàn)LONP1 下調(diào)的情況。針對柄孢霉（Podospora anserina）LON 的研究發(fā)現(xiàn)，該酶表達(dá)上調(diào)可延長柄孢霉的壽命，而對其呼吸、生長、繁殖等均無不利影響，同時可增加ATP 依賴性蛋白酶活性，產(chǎn)生低水平的氧化蛋白、糖化蛋白及。因此，未來或可通過維持LON 的活性、誘導(dǎo)異常蛋白的清除來延緩衰老、延長壽命以及提高老年生活質(zhì)量。

LONP1 的下調(diào)還參與了一系列神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等的發(fā)生與發(fā)展。由于LONP1 表達(dá)的下調(diào)，使得異常蛋白質(zhì)的降解受阻而出現(xiàn)堆積，導(dǎo)致線粒體功能紊亂、結(jié)構(gòu)喪失，繼而誘發(fā)凋亡[22]。如在早發(fā)性常染色體隱性帕金森病中，編碼PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）的PARK6基因可發(fā)生突變；然而在健康細(xì)胞中PINK1 能夠被快速降解。由于LONP1 表達(dá)的下降使得PINK1 在線粒體基質(zhì)中大量堆積，繼而誘發(fā)線粒體自噬，導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生。除神經(jīng)退行性疾病外，精神障礙性疾病如焦慮和抑郁的發(fā)生也被認(rèn)為與氧化應(yīng)激引起炎癥以及相應(yīng)的毒性蛋白的清除能力下降有關(guān)[23]。

LONP1 水平還與2 型糖尿病的胰島素抵抗及肝臟糖異生功能異常有關(guān)。研究[2]顯示，LONP1 表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)受損、葡萄糖異生酶水平升高，而其過表達(dá)則會降低胰島素抵抗，緩解2 型糖尿病。

4.3 LON 表達(dá)上調(diào)

在一些線粒體相關(guān)疾病如遺傳性共濟失調(diào)（hereditary ataxia，HA）、肌陣攣癲癇伴破碎紅纖維（myoclonic epilepsy and ragged-red fibers，MERRF）綜合征中，常伴有LON表達(dá)上調(diào)或活性增強[2]。目前，在上述疾病中，LONP1 功能的變化在疾病中的作用尚未被闡明。

在腦缺血與心肌缺血疾病的發(fā)展過程中，由于機體缺血、缺氧，LONP1 的表達(dá)則有所增加[9]。在心肌缺血-再灌注損傷下，CcO4-1 的降解逐漸增加。CcO4-1 功能的受損可誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），繼而發(fā)生線粒體功能障礙誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[24]。因此，有望通過抑制LONP1 的表達(dá)改善由缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷。在缺血性腦卒中大鼠模型（大腦中動脈閉塞）中，腦缺氧/缺血可引起嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而LON 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平則出現(xiàn)上調(diào)，也證實了LON 參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)這一過程[25]。

目前有較多資料顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與LONP1 的長期表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。在多種腫瘤如淋巴瘤、肝細(xì)胞癌中，與非癌組織相比，癌組織具有更高水平的LONP1 表達(dá)和活性；且在宮頸癌組織中LONP1 的表達(dá)比健康宮頸組織高出2 倍[26]。敲除LONP1 則能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、降低細(xì)胞呼吸，限制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。同樣地，在結(jié)腸癌中沉默LONP1 可降低線粒體DNA 和氧化磷酸化復(fù)合物水平，改變線粒體蛋白組的表達(dá)，從而抑制線粒體功能，促進細(xì)胞死亡[27]。

總之，LONP1 的表達(dá)異?？善茐募?xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是多種慢性疾病的潛在致病因素。

5 LON 的干預(yù)

基于LON 與疾病、衰老的發(fā)生密切相關(guān)，以及蛋白酶體抑制劑在臨床的應(yīng)用，科學(xué)家們逐漸對LON 的干預(yù)藥物的研發(fā)產(chǎn)生了興趣。在蛋白酶體抑制劑中，MG132、MG262 能夠抑制LON 活性，且兩者對LON 的抑制效率是對20S 蛋白酶體的2 000 倍[28]。香豆素衍生物是首個被報道的具有潛在利用價值的非多肽小分子LON 抑制劑，且未發(fā)現(xiàn)其有抑制其他蛋白酶（如蛋白酶體）的能力，其可能穿過血腦屏障在大腦中發(fā)揮作用，有望成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的藥物[29]。CDDO（2-cyano- 3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid）及其衍生物可通過抑制LON 水解活性促進B 淋巴細(xì)胞凋亡。在惡性淋巴瘤細(xì)胞中，LON 表達(dá)水平顯著升高，而LON 表達(dá)下調(diào)則會導(dǎo)致淋巴瘤細(xì)胞死亡，進一步證明了線粒體LON 可能成為新的抗癌藥物靶點[27]。Obtusilactone A 和（-） -sesamin是從肉桂中提取的2 種化合物，是強效的LON 抑制劑，能夠與LON 活性位點Ser855 和Lys898 殘基結(jié)合而發(fā)揮作用。在LON 表達(dá)水平較高的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，Obtusilactone A 或（-） -sesamin 可下調(diào)LON 的表達(dá)，從而觸發(fā)由caspase-3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[30]。雖然在衰老或神經(jīng)退行性疾病中LON 的功能不足，誘導(dǎo)LON 或?qū)⑹且粋€較好的策略，但目前僅有少量的采用基因手段開展的實驗室干預(yù)研究，尚未見相關(guān)成熟報道。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，LON 在維護細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮了重要作用，其異常表達(dá)跟多種疾病和衰老密切相關(guān)，因此開發(fā)靶向LON 的臨床藥物或?qū)⑹羌膊≈委熍c衰老干預(yù)的又一方向。但目前，有關(guān)LON 如何參與體內(nèi)的生理過程還有較多未知的地方，例如LON 在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中如何精確調(diào)控與被調(diào)控，其異常表達(dá)所帶來的影響將涉及哪些方面。鑒于腫瘤伴隨LON 功能的增強，而衰老伴隨LON 功能的降低，在矛盾的兩側(cè)我們將如何來精準(zhǔn)干預(yù)仍有待深入研究。

參·考·文·獻(xiàn)

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