PRMT4 在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的作用和機(jī)制研究

竇 敏 ，鄭英霞，韓 麗，趙 倩

1. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，上海 200025；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092

胃癌是消化道常見(jiàn)的腫瘤之一，是全世界發(fā)病率排名第四位的惡性腫瘤，其死亡率在所有癌癥中排名第三位[1]。亞洲地區(qū)胃癌的發(fā)病率和死亡率較高，尤其是日本、韓國(guó)、蒙古和中國(guó)，在中國(guó)胃癌已經(jīng)成為引起死亡的第二大腫瘤[2]。2015 年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[3]顯示，在中國(guó)胃癌的致死率較高，有約50 萬(wàn)的死亡病例。胃癌發(fā)病的分子生物學(xué)因素復(fù)雜，與許多腫瘤基因、抑癌基因有關(guān)。因而揭示胃癌發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制對(duì)診斷與治療胃癌具有重大意義[4]。

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）家族是一類(lèi)能夠甲基化組蛋白或非組蛋白精氨酸基團(tuán)的酶類(lèi)。精氨酸甲基化是重要的翻譯后修飾，參與各種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)[5]。其中PRMT4 也稱(chēng)為共激活蛋白相關(guān)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（coactivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM1），能夠使蛋白底物的精氨酸殘基非對(duì)稱(chēng)性地二甲基化[6]。PRMT4 是PRMTs 家族中第一個(gè)功能上與基因轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)的成員[7]，參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過(guò)程。PRMT4 已被證實(shí)在多種腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)，如乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、結(jié)直腸癌[10]等，其過(guò)表達(dá)不僅刺激大量致癌通路關(guān)鍵因子，如FOS（Fos protooncogene）、E2F1（E2F transcription factor 1）、Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、核受體共激活因子3（nuclear receptor coactivator 3，NCOA3，又稱(chēng)AIB1）等，而且為腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲與轉(zhuǎn)移提供一個(gè)有利的微環(huán)境[11-12]。目前，有研究[13]表明，隨著胃癌的進(jìn)展、胃癌干細(xì)胞干性增強(qiáng)，PRMT4 表達(dá)量明顯上調(diào)，提示PRMT4 可能促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的干性，但其確切機(jī)制不甚明了。除此之外，PRMT4在胃癌中的作用還沒(méi)有得到深入的研究。

本文在胃癌臨床組織標(biāo)本檢測(cè)的基礎(chǔ)上，體外利用胃癌細(xì)胞株探索PRMT4 在胃癌中的表達(dá)、在胃癌生長(zhǎng)和發(fā)展中的作用及潛在的機(jī)制，以期為胃癌的診斷和治療提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

ABI 7900 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（ABI，美國(guó)）、無(wú)菌超凈工作臺(tái)（Labconco，美國(guó)）、倒置熒光顯微鏡（Olympus，JPN）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Revco，美國(guó)）、低溫水平離心機(jī)（HITACHI，日本）、小型EP 管離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器，中國(guó)）、純水儀（Merk Millipore，美國(guó)）、FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）、垂直電泳儀及膜轉(zhuǎn)移裝置（Bio-Rad，美國(guó)）、Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（LI-COR，美國(guó)）、GloMax 20/20 發(fā)光檢測(cè)儀（Promega，美國(guó)）。

1.2 主要材料和試劑

人胃癌細(xì)胞株MGC-803、MKN-45、SGC-7901 均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；細(xì)胞培養(yǎng)所用高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗、胰酶（Gibco，美國(guó)），蛋白裂解液、一抗稀釋液（碧云天，中國(guó)），RNA 提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)），mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq 定量PCR 試劑盒（TaKaRa，中國(guó)），細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipo3000（Thermo Fisher，美國(guó)），Annexin V/7-AAD 凋亡試劑盒、遷移試劑盒、侵襲試劑盒（BD，美國(guó)）。短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）由上海吉?jiǎng)P生物設(shè)計(jì)合成，PCR引物由上海工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）所用抗體包括：PMRT4 蛋 白、β-catenin，活 化 的β-catenin［non-phospho （active） β-catenin，ABC］、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）；磷酸化糖原合成酶激酶3β（phospho glycogen synthase kinase-3β，p-GSK3β）、C-myc（cellular-myelocytomatosis viral oncogene） 蛋 白、N- 鈣 黏 蛋白（N-cadherin）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）?？贵w貨號(hào)及來(lái)源如下：PRMT4（NBP2-37645，Genetex，美國(guó)），β-catenin、ABC、N-cadherin、C-myc（8480、19807、13116、18583，Cell Signaling， 美 國(guó)），GSK3β、p-GSK3β（sc-71186、sc-81496，Santa Cruz，美國(guó)），β-actin（A1978，Sigma，美國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 使用谷歌生物商品化的胃癌組織芯片（含32 對(duì)胃癌和癌旁組織）進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。組織芯片置于56 ℃恒溫箱烘烤2 h 后分別浸入二甲苯及無(wú)水乙醇浸泡進(jìn)行脫蠟與水化；將其放入緩沖液，置于微波爐中加熱，使容器內(nèi)液體溫度維持在92 ～98 ℃，持續(xù)10 ～15 min。取出容器，冷卻10 ～20 min；封閉液封閉15 min，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；1×PBS 洗滌3 次，加入二抗，室溫孵育2 h，1×PBS 洗滌3 次后加入親和素 - 生物素 - 過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30 min。1×PBS 洗滌3 次，進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，蘇木精復(fù)染，脫水并封片。染色結(jié)果評(píng)分根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率被定為：＜5%，0 分；5%～25%，1分；26%～50%，2 分；51%～75%，3 分；＞75%，4 分。對(duì)每對(duì)胃癌組織和癌旁組織的評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 在UALCAN 網(wǎng)站上分析PRMT4在34 例正常組織和415 例胃癌組織中的表達(dá)差異。UALCAN 網(wǎng)站樣本均來(lái)自TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫(kù)。在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了2 個(gè)樣本庫(kù)的胃癌組織，分別為80 例正常組織與80 例胃癌組織、19 例正常組織與31 例彌漫性胃腺癌組織。生存期分析在Kaplan-Meier Plotter 網(wǎng)站上進(jìn)行，樣本庫(kù)包含1 051 例胃癌組織；總生存期分析中含有275 例低表達(dá)PRMT4 的胃癌患者和601 例高表達(dá)PRMT4 的胃癌患者信息，無(wú)病進(jìn)展生存期中含有241 例低表達(dá)PRMT4 的胃癌患者和400 例高表達(dá)PRMT4 的胃癌患者信息；樣本編 號(hào) 為GSE14210、GSE15459、GSE22377、GSE29272、GSE51105 和GSE62254。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)均使用DMEM 培養(yǎng)基在含有5% CO2的37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10% FBS 以及100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素。

1.3.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 沉默和過(guò)表達(dá)PRMT4（NM-199141）均采用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法。沉默PRMT4 所用質(zhì)粒名稱(chēng)GV493，2個(gè)敲減序列分別為 ATGACTTGAGCAGTGTTAT（SH1） 和 AGAACATGATGCAGGACTA（SH2）， 對(duì) 照序列為T(mén)TCTCCGAACGTGTCACGT（NC）。過(guò)表達(dá)所用質(zhì)粒名稱(chēng)GV146，克隆位點(diǎn)Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ，長(zhǎng)度為1 874 bp。轉(zhuǎn)染前1 日，將待轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞接種6 孔板。第2 日，按lipo3000 試劑盒明書(shū)配制轉(zhuǎn)染預(yù)混合液，室溫靜置20 min。去除培養(yǎng)基，1×PBS 洗滌2 次，加入不含抗生素、含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，然后加入轉(zhuǎn)染預(yù)混合液，充分混勻。在含有5% CO2的37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，換成含抗生素和10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.5 MTT 增殖實(shí)驗(yàn) 在MGC-803 和MKN-45 細(xì)胞中敲減PRMT4，分為SH1 組、SH2 組和NC 組；在SGC-7901 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PRMT4，分為過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（OVER）和空載（VECTOR）2 組；之后進(jìn)行MTT 增殖實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞，按每孔1 000 個(gè)接種于96孔板中，周邊孔加等體積PBS，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中；24 h后，向96 孔板每孔中加入20 μL MTT 溶液，4 h 后去除培養(yǎng)液，每孔中加入200 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩5 min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解；使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm 下測(cè)定吸光度。連續(xù)檢測(cè)5 d，根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組同1.3.5。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，以每孔250 個(gè)接種于6 孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)4 ～6 周，直到形成肉眼可見(jiàn)的克隆后，棄培養(yǎng)基，用1×PBS 洗滌3 次，使用4%的多聚甲醛固定液固定細(xì)胞15 min；去除固定液，用1×PBS 洗滌3次，用0.05%結(jié)晶紫溶液染色15 min，使用1×PBS 洗滌后風(fēng)干。拍照并記錄所形成的細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.3.7 細(xì)胞凋亡分析 細(xì)胞分組同1.3.5。首先用胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用1×binding buffer 稀釋細(xì)胞，最終稀釋成1×106個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液。吸取100 μL 細(xì)胞懸液至流式管中，分別加入5 μL PE-Annexin V 和5 μL 7-ADD。輕輕混勻后室溫避光反應(yīng)15 min。最后每管中加入400 μL 1×binding buffer，并在1 h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。分別計(jì)算早期凋亡和中晚期凋亡細(xì)胞比例。

1.3.8 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組同1.3.5。遷移實(shí)驗(yàn)采用8 μm PET（聚酯）膜Corning Transwell inserts（插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿），侵襲實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)膠（matrigel）預(yù)包被的8 μm Corning Transwell inserts。實(shí)驗(yàn)前預(yù)先將Transwell inserts 從冰箱拿出至室溫平衡30 min。含matrigel 的小室要預(yù)先放置在24 孔板中，上層加無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)平衡2 h。消化并洗滌細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞使得最終的細(xì)胞密度達(dá)到5×104個(gè)/mL。24 孔板的孔中加入750 μL 含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，insert 小室中加入500 μL 細(xì)胞懸液。將24 孔板培養(yǎng)48 h 后，取出小室，洗滌固定以及染色，最后擦去小室內(nèi)部未遷移到下面的細(xì)胞，晾干，用顯微鏡在200 倍下觀(guān)察，隨機(jī)選取5 個(gè)不同的視野拍照。

1.3.9 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 在MGC-803 細(xì)胞中敲減PRMT4，分為SH2 組和NC 組，之后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。TOP［含有野生型的T 細(xì)胞因子（T cell factor）結(jié)合序列］ /FOP（含有突變的TCF 結(jié)合序列）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，將培養(yǎng)板取出，1×PBS 洗3 次；加入100 μL 裂解液，室溫振蕩孵育15 min，收集裂解液至EP 管中，4 ℃、13 000×g 離心10 min；吸取10 μL 蛋白裂解液加至50 μL螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑中，迅速混勻，放入GloMax 20/20 發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光強(qiáng)度；加入50 μL 終止液，再次檢測(cè)熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算TOP/FOP 質(zhì)粒熒光素酶活性比值。

1.3.10 RNA 提取和real-time PCR 檢測(cè) 細(xì)胞分組同1.3.9。使用RNA 提取試劑盒抽取細(xì)胞株中RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR 反應(yīng)體系10 μL：SYBR Premix EX Taq 5 μL，PCR 上 游 引 物（10 μmol/L）0.2 μL，PCR 下游引物（10 μmol/L） 0.2 μL，Rox 參比染料0.2 μL，模板cDNA 1 μL，dd H2O 3.4 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 s；PCR 反 應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，循 環(huán)40 次。使用ABI 7900 實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。管家基因Actin 作為內(nèi)對(duì)照。使用公式2-ΔΔCT進(jìn)行不同組間基因表達(dá)差異的比較。檢測(cè)基因包括：PRMT4、C-myc、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、survivin、基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metallopeptidase 7，MMP-7）、淋巴樣增強(qiáng)因子-1（lymphoid enhancer binding factor 1，LEF1）、Wnt 信號(hào)通路抑制因子（Dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 1，DKK1）以及AXIN2。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR 檢測(cè)基因引物序列 Tab 1 Forward and reverse primers of real-time PCR

1.3.11 Western blotting 在MGC-803 和MKN-45 細(xì) 胞中敲減PRMT4，分為SH2 組和NC 組；在SGC-7901 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PRMT4，分為OVER 組和VECTOR 組。將經(jīng)過(guò)定量的蛋白與蛋白上樣緩沖液按比例加好后置于沸水浴中煮5 min，12 000×g 離心5 min，將管壁上蒸發(fā)的水離心至管底，振蕩混勻后上樣。以恒壓90 V 進(jìn)行電泳直到溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部時(shí)停止。將聚偏氟乙烯（PVDF）膜用甲醇活化1 min 后，連同濾紙、電轉(zhuǎn)夾板浸泡在電轉(zhuǎn)液中；將電轉(zhuǎn)夾板取出，從下到上按照白板、海綿墊、2 層濾紙、PVDF 膜、分離膠、2 層濾紙、海綿墊和黑板的順序?qū)㈦娹D(zhuǎn)夾板固定好，放入電轉(zhuǎn)槽中；恒壓100 V 2 h 后，將PVDF 膜用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉，室溫置于搖床上1 h 后用一抗孵育，4 ℃過(guò)夜；回收一抗，用TBST 洗膜后用二抗室溫孵育1 h；棄掉二抗并用TBST 洗膜后用Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PRMT4 在胃癌中高表達(dá)且與患者生存期相關(guān)

為了研究PRMT4 在胃癌中的表達(dá)，在蛋白水平上，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析了PRMT4 在32 對(duì)癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PRMT4 在胃癌組織中高表達(dá)（圖1A）。在基因水平上，用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分析PRMT4 在胃癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PRMT4 在胃癌中的表達(dá)水平較正常組織顯著增高（圖1B）。另外，還用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析了2 個(gè)樣本庫(kù)的胃癌組織（圖1C），同樣發(fā)現(xiàn)PRMT4 的表達(dá)水平在胃癌中顯著增高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。

圖1 PRMT4 在胃癌中的表達(dá)Fig 1 PRMT4 expression in gastric cancer

為了探究PRMT4 對(duì)胃癌患者生存期的影響，我們通過(guò)在Kaplan-Meier Plotter 網(wǎng)站上分析胃癌患者的生存期發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)PRMT4 的胃癌患者的總體生存期（圖2A）和無(wú)病進(jìn)展生存期（圖2B）較低表達(dá)PRMT4 的胃癌患者明顯縮短，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。綜上可見(jiàn)，PRMT4 在胃癌中高表達(dá)且高表達(dá)PRMT4 的胃癌患者生存期顯著縮短。

圖2 胃癌患者PRMT4 表達(dá)與其生存期的關(guān)系Fig 2 Relationship between expression of PRMT4 and survival time in patients with gastric cancer

2.2 沉默PRMT4 抑制胃癌細(xì)胞的增殖

為進(jìn)一步研究PRMT4 在胃癌中的生物學(xué)功能，分別在PRMT4 表達(dá)相對(duì)較高的2 個(gè)胃癌細(xì)胞株MGC-803 和MKN-45 中進(jìn)行沉默實(shí)驗(yàn)。分別轉(zhuǎn)染2 個(gè)位點(diǎn)的shRNAs（SH1 和SH2），shRNAs 轉(zhuǎn) 染 后PRMT4 的 蛋 白 水 平 較NC 明顯下降（圖3A），證明利用干擾技術(shù)有效地抑制了PRMT4 的表達(dá)。在用shRNAs 敲低PRMT4 的表達(dá)后，通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)連續(xù)5 d 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SH1 和SH2 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞較NC 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的增殖能力顯著降低（圖3B）。同樣用克隆形成實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果，SH1 和SH2 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞較NC 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯減少（圖3C）。繼而利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的周期與凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默PRMT4對(duì)胃癌細(xì)胞的周期沒(méi)有明顯改變，而SH1 和SH2 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡要明顯多于NC 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（圖3D），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上可見(jiàn)，沉默PRMT4 抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成能力，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。

圖3 沉默PRMT4 抑制胃癌細(xì)胞的體外增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡Fig 3 Deletion of PRMT4 suppressed gastric cancer cell proliferation in vitro, and induced gastric cancer cell apoptosis

2.3 沉默PRMT4 抑制胃癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移

分別轉(zhuǎn)染NC、SH1 和SH2 后，利用inserts 小室及包裹有matrigel 基質(zhì)膠的inserts 小室評(píng)估胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的能力。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染SH1 和SH2 后的胃癌細(xì)胞遷移至inserts 小室及帶基質(zhì)膠inserts 小室下面的數(shù)量較NC 明顯減少（圖4），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明沉默PRMT4 后，胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及向周?chē)M織浸潤(rùn)的能力均明顯下降。

圖4 沉默PRMT4 抑制胃癌細(xì)胞的體外侵襲與遷移Fig 4 Deletion of PRMT4 suppressed gastric cancer cell migration and invasion in vitro

2.4 過(guò)表達(dá)PRMT4 促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移

在PRMT4 表達(dá)相對(duì)較低的胃癌細(xì)胞株SGC-7901 中進(jìn)行過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有效（圖5A）。MTT實(shí)驗(yàn)連續(xù)5 d 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力較VECTOR 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞顯著增高（圖5B）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞較VECTOR 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯增加（圖5C）。過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡也明顯少于VECTOR 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（圖5D）。另外，轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后的胃癌細(xì)胞遷移至inserts 小室及帶基質(zhì)膠inserts 小室下面的數(shù)量較VECTOR 明顯增加（圖5E、F），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)PRMT4促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成能力，抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

圖5 過(guò)表達(dá)PRMT4 促進(jìn)胃癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲與遷移Fig 5 Overexpression of PRMT4 induced gastric cancer cell proliferation, migration and invasion in vitro

2.5 PRMT4 可能參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路

在胃癌中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路存在異?；罨痆14]，從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生和發(fā)展。為了研究PRMT4 在Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中發(fā)揮的潛在作用，首先檢測(cè)了干擾PRMT4 后胃癌細(xì)胞中內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子TCF 的轉(zhuǎn)錄活性。干擾實(shí)驗(yàn)均使用MGC-803 細(xì)胞和干擾效果較好的SH2 質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾PRMT4 可以顯著抑制MGC-803 細(xì)胞中內(nèi)源性TCF 的轉(zhuǎn)錄活性（圖6A）。PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了干擾PRMT4 后，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路下游靶基因的表達(dá)水平變化；結(jié)果顯示：沉默PRMT4 可降低MGC-803 細(xì)胞Wnt 下游靶基因C-myc、cyclin D1、survivin、MMP-7、 LEF1 和AXIN2 的表達(dá)，升高DKK1 的表達(dá)（圖6B）。Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin、ABC、GSK3β、p-GSK3β 以及下游靶基因蛋白C-myc 和N-cadherin 的表達(dá)；結(jié)果顯示：PRMT4可能通過(guò)影響ABC、p-GSK3β 和Wnt 下游靶基因蛋白C-myc 和N-cadherin 發(fā)揮其對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用（圖6C）。

圖6 PRMT4 參與調(diào)控胃癌Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活性Fig 6 PRMT4 regulated Wnt/β-catenin signaling pathway in gastric cancer

3 討論

胃癌在我國(guó)具有較高的發(fā)病率和死亡率，其發(fā)生是多基因表達(dá)異常和多途徑導(dǎo)致的。目前胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，因而我們選擇胃癌作為研究對(duì)象，從中挖掘與其發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子，以期為胃癌的診斷與治療提供潛在的靶標(biāo)。PRMT4 作為PRMTs 家族的一員，可以對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，引起表觀(guān)遺傳學(xué)的改變，它也可以通過(guò)與多種特異的轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾酶相互作用調(diào)控多種重要的細(xì)胞信號(hào)通路。研究[15]已經(jīng)證實(shí)PRMT4 在多種腫瘤組織（結(jié)直腸癌、骨肉瘤、乳腺癌等）中表達(dá)升高并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。本文擬探索PRMT4 在胃癌中的作用。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織的PRMT4 表達(dá)水平顯著高于正常組織，并且高表達(dá)PRMT4 的患者的總體生存期顯著縮短；組織芯片檢測(cè)也獲得了PRMT4 在胃癌組織高表達(dá)的結(jié)果。因此，進(jìn)一步研究PRMT4 在胃癌中的功能。研究發(fā)現(xiàn)：干擾PRMT4 抑制了胃癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡；相反，過(guò)表達(dá)PRMT4 則促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，抑制了胃癌細(xì)胞的凋亡?？梢?jiàn)，PRMT4 在胃癌中扮演著癌基因的角色。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制中較經(jīng)典的信號(hào)通路，其異常活化存在于各種良性及惡性腫瘤[16]，并且與患者預(yù)后有著密切的關(guān)系[17]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路還參與表皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transitions，EMT），且抑制Wnt 信號(hào)通路后可觀(guān)察到腫瘤細(xì)胞的凋亡增加，細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制[18]。胃癌的發(fā)生和發(fā)展離不開(kāi)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)控。PRMT4 作為β-catenin 蛋白轉(zhuǎn)錄的一個(gè)重要調(diào)節(jié)器[19]，已經(jīng)在結(jié)直腸癌[19]、骨肉瘤[20]等中被證實(shí)其通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此我們也想了解在胃癌細(xì)胞中PRMT4 是否參與調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，干擾PRMT4 后顯著抑制了胃癌細(xì)胞中內(nèi)源性TCF 的轉(zhuǎn)錄活性，并且明顯降低了Wnt下游靶基因的表達(dá)。C-myc[21]、cyclin D1[22]、survivin[23]和 MMP-7[22]都是比較經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路靶基因，它們參與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、凋亡[24]及侵襲與轉(zhuǎn)移；而轉(zhuǎn)錄因子Lef1[25]和β-catenin 降解復(fù)合物成員Axin2[26]都是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中重要的參與者；上述分子的表達(dá)水平降低均意味著Wnt 信號(hào)通路受到了抑制。對(duì)于DKK1來(lái)說(shuō)，它既是下游的靶基因，也是Wnt 信號(hào)通路的抑制因子；通常Wnt 信號(hào)受到激活時(shí)，DKK1 能夠負(fù)反饋性地升高；相反Wnt 信號(hào)受到抑制時(shí)，DKK1 則降低。本研究中，我們認(rèn)為干擾PRMT4 后能夠抑制Wnt 信號(hào)通路，而PCR 結(jié)果顯示DKK1 表達(dá)水平反而升高，這可能是由于胃癌細(xì)胞缺失了DKK1 對(duì)于Wnt 信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，這一點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。隨后在Western blotting實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，干擾PRMT4 后可降低ABC、p-GSK3β 以及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路下游蛋白C-myc 和N-cadherin的表達(dá)。過(guò)表達(dá)PRMT4 后可升高ABC、p-GSK3β 以及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路下游蛋白C-myc 和N-cadherin 的表達(dá)。同樣驗(yàn)證了PRMT4 參與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。C-myc 作為經(jīng)典靶蛋白之一，參與腫瘤細(xì)胞的增殖分化；N-cadherin 作為β-catenin 的下游分子可以與之結(jié)合，參與EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[27]。由此可見(jiàn)，PRMT4 可能通過(guò)參與調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而影響胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及侵襲與轉(zhuǎn)移。

總而言之，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了PRMT4 與胃癌的發(fā)生和發(fā)展有著重要的聯(lián)系。作為一種促癌基因，其或許可以為胃癌的診斷與治療提供新的思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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