阿苯達唑?qū)π∈髣用}血管狹窄的干預(yù)效果及機制研究

路芳芳，姚佳璐，鈕曉音，翁 震，何 楊,

1.江蘇省血液研究所，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006；2. 江蘇省蘇州市立醫(yī)院心內(nèi)科，蘇州 215002；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025；4. 蘇州大學(xué)血液和血管疾病診療藥物技術(shù)教育部工程研究中心，蘇州 215123

血管再狹窄（restenosis）是一類源于新生內(nèi)膜增殖的血管病變，在心臟和外周血管成形術(shù)、旁路移植術(shù)、動脈內(nèi)膜切除術(shù)及人工動靜脈簍術(shù)后均有可能出現(xiàn)，被認(rèn)為是影響血管置換術(shù)和血管成形術(shù)遠(yuǎn)期療效的主要原因[1]。臨床研究[2-3]顯示，血管再狹窄在進行血管重建術(shù)后的發(fā)生率仍然高達30%～50%。目前在臨床上，對于血管再狹窄的治療仍未找到較好的治療方法。近年來，研究[4]表明，內(nèi)側(cè)動脈層中過度的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和遷移在內(nèi)膜增生性疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。因此，如何有效抑制和控制VSMCs 的增殖和遷移是血管再狹窄疾病治療的重要切入點。

阿苯達唑（albendazole，ABZ）是一種咪唑衍生物類廣譜驅(qū)腸蟲藥物[4-5]。通過抑制寄生蟲細(xì)胞中微管形成和葡萄糖攝取發(fā)揮驅(qū)蟲作用。除了在驅(qū)蟲方面的作用外，ABZ還可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或者通過某些信號通路上調(diào)腫瘤壞死因子的表達來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。有研究[6-7]表明，微管的組裝和排列能夠影響VSMCs 的遷移。因此，我們推測ABZ 可能通過影響VSMCs 的生物學(xué)特性，包括增殖、遷移及凋亡，從而影響血管再狹窄的過程。本研究探討在外周套管誘發(fā)狹窄的小鼠模型中，ABZ 作為潛在治療藥物的作用效應(yīng)，并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人血管平滑肌細(xì)胞購自美國Life Technology 公司；ABZ、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清及100×青霉素-鏈霉素溶液購自美國Thermo Fisher 公司；細(xì)胞遷移實驗試劑I 型膠原蛋白及材料Transwell 小室（孔徑8 μm）購自美國Millipore 公司；血小板衍生的生長因子BB（PDGF-BB）購自美國R&D 公司；抗體包括兔抗人磷酸化及總肌球蛋白輕鏈2、兔抗鼠磷酸化及總絲切蛋白（cofilin，CFL）、GAPDH 購自美國Cell signaling Technology 公司；Annexin V-PI 細(xì)胞凋亡試劑盒及細(xì)胞裂解液RIPA 液購自中國南通碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實驗動物

雄性8 ～10 周齡C57BL/6 小鼠（體質(zhì)量22 ～25 g）購自北京維通利華公司，所有動物置于SPF 環(huán)境中進行飼養(yǎng)。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0009，使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0043，動物實驗及處理方案經(jīng)過蘇州大學(xué)動物倫理委員會審批（審批號201810A530）。

1.3 細(xì)胞增殖實驗

將VSMCs 調(diào)整濃度至2×104個/mL 后接種于48 孔板中，每孔0.5 mL。隨后將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置6 h 使細(xì)胞貼壁。隨后在不同孔中加入濃度為0.5、1 μmol/L 的ABZ 或等體積的DMSO 進行孵育培養(yǎng)，并在24 h 及48 h 時間點加入MTT 溶液，通過酶標(biāo)儀進行細(xì)胞存活率測定吸光度[D （490 nm） ]。

1.4 Transwell 細(xì)胞遷移實驗

參照相關(guān)文獻[8]，將500 μL Ⅰ型膠原蛋白（3.79 mg/mL） 與50 μL 的NaOH（0.2 mol/L）和100 μL 的100× 青 霉素-鏈霉素溶液混合后置于冰上，然后在混合溶液中加入3×105個重懸于250 μL DMEM/F12 的經(jīng)過血清饑餓處理5 ～6 h 的VSMCs，并充分混合。將等分的含有VSMCs的上述混合溶液（100 μL）轉(zhuǎn)移至24 孔Transwell 小室的上室中，隨后將Transwell 小室在37 ℃下孵育20 min以形成凝膠，取出后在下室中加入0.6 mL 含2.5% FBS、PDGF-BB 和ABZ（0.5 或1 μmol/L）或DMSO 對 照 的DMEM/F12 培養(yǎng)基。同時，在上室的凝膠上部加入含有2.5% FBS 和相同濃度的ABZ 或DMSO 對照的DMEM/F12 培養(yǎng)基（0.1 mL）進行覆蓋。然后，將Transwell 板置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)條件下孵育48 h。為了量化VSMCs 通過凝膠和Transwell 孔遷移至多孔膜下部腔室表面的過程，收集上部小室并通過浸入4%多聚甲醛中進行固定。用棉簽去除凝膠并拭去上室膜表面未遷移的細(xì)胞。割下Transwell 的多孔膜后，按照產(chǎn)品說明書用Diff-Quik染色套件（德國Siemens 公司）染色。于100 倍正置顯微鏡下隨機選取每個膜的4 個區(qū)域進行計數(shù)并求和，得出遷移細(xì)胞的總數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡

將VSMCs 調(diào)整濃度至3×104個/mL 后接種于6 孔板中，每孔2 mL。隨后將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置6 h 使細(xì)胞貼壁。隨后在不同孔中加入濃度為0.5、1 μmol/L 的ABZ 或等體積的DMSO 進行孵育培養(yǎng)，并在48 h 后采用Annexin V-FITC/PI 染色法評估細(xì)胞凋亡。將處理后的細(xì)胞與5 μL Annexin V-FITC 混合，在室溫下避光孵育10 min，隨后通過PBS 洗滌后加入10 μL PI于室溫下避光孵育10 min。使用Beckman-Coulter Gallios流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞凋亡檢測，通過儀器自帶的Kaluza Analysis 軟件分析結(jié)果。

1.6 小鼠股動脈外周套管血管狹窄模型構(gòu)建及ABZ 處理

術(shù)前將小鼠通過腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉進行麻醉。將其以仰臥位固定并置于解剖顯微鏡下，采用眼科剪在小鼠腿內(nèi)側(cè)切開一條1 ～2 cm 的縱向切口，并使用顯微鑷從股神經(jīng)和股靜脈與股動脈分離，長度為3 mm。采用長度為2.0 mm 縱向切開細(xì)孔PE 管（內(nèi)徑0.41 mm，外徑0.51 mm；英國Smith 公司）套在股動脈周圍，兩端套管通過6/0 縫合線結(jié)扎以實現(xiàn)血流部分阻斷。通過連續(xù)縫合針法縫合切口皮膚后，將小鼠置于干凈鼠籠靜待復(fù)蘇。

將建模后的小鼠進行分組，每組各10 只小鼠。①實驗組：每天用溶解于芝麻油中的1.5 mg ABZ 進行灌胃。②對照組：每天采用等體積的芝麻油進行灌胃。在模型建立后第2 天上午開始第一次灌胃，并將實驗組和對照組小鼠在模型建立后置于含有高脂飼料（TP28600，南通特洛菲飼料有限公司）的籠中進行飼養(yǎng)。4 周后通過心臟灌注含4%甲醛的PBS 處死動物，并獲得股動脈進行組織學(xué) 分析。

1.7 組織學(xué)和形態(tài)分析

切下兩側(cè)股動脈，包埋在石蠟塊中，切成5 μm 薄片并進行蘇木精 - 伊紅（H-E）染色。采用Leica DM2000 顯微鏡圖像采集后，從每條動脈中選擇每600 mm2截取的3 個 橫截面進行定量。使用Image J 軟件分析圖像。測量內(nèi)膜（intima）和中膜（media）區(qū)域，并計算內(nèi)膜與中膜的比例（I/M）。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）分析

將VSMCs 在0.5 或1 μmol/L ABZ 或 等 體 積DMSO存在的情況下，聯(lián)合20 ng/mL PDGF 處理24 ～48 h 后，使用適量的RIPA 溶液將VSMCs 裂解，12 000×g、4 ℃下離心15 min，獲得含有蛋白的上清溶液。經(jīng)過BCA 法進行蛋白定量后，將含有30 ～50 μg 蛋白的樣品溶液在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，將膜用5%脫脂牛奶中封閉2 h 后，在4 ℃條件下與一抗（1:1 000）孵育過夜。將PVDF 膜在含1% Tween-20 的PBS 中洗滌3 次后，與適當(dāng)濃度的HRP標(biāo)記的二抗（1:50 000 稀釋）于室溫下孵育1 h，重復(fù)上述洗膜后，采用ECL 底物試劑盒顯影曝光，對特異性蛋白條帶采用Image J 軟件進行半定量分析。采用GAPDH蛋白作為內(nèi)參對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析結(jié)合Tukey HSD 與SNK 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABZ 濃度確定

將VSMCs 與不同濃度的ABZ 進行孵育后，構(gòu)建IC50的曲線以明確ABZ 的使用濃度。結(jié)果顯示，ABZ 濃度為0.5 ～1 μmol/L 時能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞生長的半數(shù)抑制（圖1）。 因此，采用0.5 和1 μmol/L 作為后續(xù)實驗的濃度。

圖1 ABZ 對細(xì)胞起效的最低濃度Fig 1 Minimum concentration of ABZ to act on cells

2.2 ABZ 對VSMCs 增殖和遷移的抑制作用

0.5 和1 μmol/L ABZ 均 能 夠 顯 著 抑 制VSMCs 的 增殖（圖2A）。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示0.5 和1 μmol/L ABZ均能夠顯著抑制VMSCs 的遷移（圖2B、2C）。通過流式細(xì)胞術(shù)觀察48 h 時ABZ 對VSMCs 凋亡的影響，結(jié)果顯示1 μmol/L ABZ 能夠顯著增加VSMCs 的凋亡，而在0.5 μmol/L 時無此效應(yīng)。

2.3 ABZ 對再狹窄小鼠模型新生內(nèi)膜增生的抑制作用

體外實驗結(jié)果提示ABZ 能夠影響VSMCs 的增殖和遷移，進一步通過股動脈外周套管法構(gòu)建了小鼠血管再狹窄的模型驗證ABZ 在體內(nèi)的作用效應(yīng)。結(jié)果顯示，與對照組小鼠比較，ABZ 灌胃能夠顯著降低新生內(nèi)膜面積及I/M比值（圖3），但是對中膜面積并無顯著效應(yīng)。

2.4 ABZ 干預(yù)血管再狹窄的作用機制

相較于對照溶劑DMSO 處理，0.5 和1 μmol/L ABZ處理均能夠顯著抑制CFL 去磷酸化和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）的磷酸化，且呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢（均P＜0.05），見圖4。

圖2 ABZ 對VSMCs 增殖、遷移及凋亡的影響Fig 2 Effects of ABZ on proliferation, migration and apoptosis of VSMCs

3 討論

VSMCs 在許多血管疾病中起著重要作用。在發(fā)生動脈損傷時，VSMCs 通過從靜止的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋承院瓦w移性的表型進行應(yīng)答。通過增生、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，VSMCs 有助于在動脈粥樣硬化以及支架置入后再狹窄中出現(xiàn)的阻塞性血管病灶的形成[9]。隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、生活水平的提高以及人口老齡化趨勢的到來，阻塞性血管病的發(fā)病率和死亡率呈增高趨勢。盡管目前在臨床上使用的藥物洗脫支架已成功地預(yù)防了再狹窄，但是由于每年植入支架患者的數(shù)量巨大，再狹窄和復(fù)發(fā)性再狹窄仍然很普遍。因此，在臨床實踐中仍需安全有效的方法來治療復(fù)發(fā)性再狹窄。

ABZ 是苯并咪唑氨基甲酸酯類驅(qū)蟲藥，其最初作為抗寄生蟲藥于1975 年問世，并以其對人體和農(nóng)場動物的功效和低毒性而備受關(guān)注[9]。ABZ 作為能夠結(jié)合β-微管蛋白受體的激動劑，通過改變微管蛋白聚合實現(xiàn)對寄生蟲的抑制[9]。ABZ 破壞微管聚合的潛在機制，促進了其作為微管結(jié)合劑用于抗腫瘤藥物的實驗研究。先前的研究[6,10]已經(jīng)確定了幾種苯并咪唑氨基甲酸酯（包括ABZ）在多種腫瘤細(xì)胞系中的抗腫瘤效應(yīng)，主要包括肺癌、白血病和皮下鱗癌。另外，也有研究[11]評價了關(guān)于ABZ 與 2-甲氧基雌二醇或紫杉醇的組合的協(xié)同抗腫瘤作用。此外，ABZ 可抑制血管內(nèi)皮生長因子的分泌并防止惡性腹水的形成。據(jù)報道[11]，ABZ 可以通過SIRT3/ROS/P38 MAPK/TTP 軸上調(diào)腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

圖3 ABZ 在再狹窄小鼠模型中對內(nèi)膜增生的抑制作用Fig 3 Effect of ABZ on intimal hyperplasia in a murine model of restenosis

圖4 ABZ 對CFL 和MLC 磷酸化的影響Fig 4 Effects of ABZ on CFL and MLC phosphorylation

本研究結(jié)果表明，ABZ 還可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。這與微管組織的破壞和其他細(xì)胞骨架成分如絲狀肌動蛋白分布的繼發(fā)變化有關(guān)。ABZ 處理可能導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白的重排，從而影響了VSMCs 的生物學(xué)功能。盡管由ABZ 誘導(dǎo)的凋亡可能有助于抑制作用，但該因素在血管狹窄模型中并非主要決定因素。重要的是，ABZ治療可有效減少動脈損傷后新內(nèi)膜的形成，而該作用被認(rèn)為是通過在損傷部位抑制VSMCs 增殖和遷移介導(dǎo)的，而且并不影響體內(nèi)血管的再內(nèi)皮化。因此，該療法可用于治療與病理性VSMCs 增殖有關(guān)的血管疾病。另外，ABZ 的優(yōu)勢還在于具有較低的不良反應(yīng)風(fēng)險，并且這種低毒效應(yīng)即使在人體中進行長期服用亦是如此[9]。在本研究中，我們也未觀察到明顯的不良反應(yīng)。

目前，有關(guān)VSMCs 遷移的分子機制已得到充分描述，其始于將外部配體結(jié)合轉(zhuǎn)化為內(nèi)部生化事件的生長因子和炎癥細(xì)胞因子受體的結(jié)合，包括PDGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和腫瘤壞死因子在內(nèi)的多種可溶性配體復(fù)合物能夠在VSMCs誘導(dǎo)遷移[12]。而參與VSMC 遷移的蛋白主要包括GTPases（如RhoA 和Rac1）、絲裂原激活的蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶（如p38）以及細(xì)胞骨架和肌動蛋白重構(gòu)蛋白[如CFL、MLC 及熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）27]。這些蛋白的協(xié)調(diào)激活使平滑肌細(xì)胞突出偽足，實現(xiàn)肌動蛋白重構(gòu)，并允許細(xì)胞向趨化刺激遷移。MLC 磷酸化是SMC 遷移中必不可少的生化事件，因為它啟動了肌球蛋白ATPase 活性、肌動蛋白聚合以及組織定向細(xì)胞運動所必需的功能性肌動蛋白-肌球蛋白運動單位[13]。許多趨化性細(xì)胞因子通過激活MLC 磷酸化來啟動遷移[13]。另外，MAPK 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移需要MLC 磷酸化[13]。本研究檢測到ABZ 處理后能夠顯著降低MLC 的磷酸化。之前的研究[8]顯示，CFL 在未刺激的VSMCs 中以磷酸化狀態(tài)存在，當(dāng)出現(xiàn)PDGF 激活后，其活性受去磷酸化作用的調(diào)節(jié)，從而使其能夠與遷移細(xì)胞的主要片狀脂膜上的F- 肌動蛋白結(jié)合影響VSMCs 的遷移。在本研究中，我們觀察到了CFL磷酸化水平在ABZ 處理的細(xì)胞中出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。

本研究存在一些不足之處。在ABZ 對細(xì)胞增殖抑制的分子機制上，之前的研究顯示ABZ 能夠通過影響細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物M 期促進因子（M-phase promoting factor，MPF）中Cdc2、cyclinA 及cyclin B 的磷酸化抑制細(xì)胞由G2期向M 期的轉(zhuǎn)化[9]，本研究并未進行檢測，可能需要在以后的研究中進一步明確。其次，有研究認(rèn)為，在發(fā)生損傷的血管中，VSMCs 會出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化，其特征為收縮標(biāo)志物表達減少，同時增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)志物表達增加[14]。本研究中對血管的H-E 染色結(jié)果提示，VSMCs 在損傷血管中的增殖和遷移顯著增加。然而，在具體的分子信號機制中，仍需進一步探索。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ABZ 通過影響細(xì)胞骨架蛋白上CFL 和MLC 的磷酸化，抑制VSMCs 遷移和內(nèi)膜增生。該結(jié)果提示，ABZ 可能是新內(nèi)膜增生和血管阻塞性疾病的重要治療藥物。

參·考·文·獻

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