西方飲食聯(lián)合小劑量四氯化碳構(gòu)建非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型研究

康建華，李明杰，欒培培，陳源文，彭文輝，簡(jiǎn)蔚霞

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200092；2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海200072；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200092

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的嚴(yán)重病理類型。目前，NAFLD 在全球及亞洲人群患病率均約為25%[1-2]，隨著肥胖及糖尿病患者的不斷增加，NAFLD 患病率將會(huì)繼續(xù)升高。雖然大部分NAFLD 患者疾病狀態(tài)只停留在非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）階段，但是仍有部分患者可向NASH 及肝纖維化進(jìn)展，最終發(fā)展為肝硬化、肝癌。在美國(guó)，NASH 導(dǎo)致的終末期肝病是肝移植的第三大病因[3]。盡管NASH 是我國(guó)目前常見的慢性肝病之一，但迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，也無特異性治療方法及特效藥物。對(duì)于NASH 的機(jī)制研究和藥物開發(fā)來說，目前最大的障礙是缺乏標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型?，F(xiàn)有的研究中，使用較多的NASH 動(dòng)物模型是通過高糖高脂飲食或甲硫氨酸膽堿缺乏飲食來構(gòu)建，然而這些模型都不能體現(xiàn)出NASH 向肝纖維化、肝癌的演變過程[4]。本研究采用西方飲食（Western diet，WD）聯(lián)合腹腔注射小劑量四氯化碳（CCl4）的方法來構(gòu)建小鼠NASH 相關(guān)肝纖維化模型，同時(shí)對(duì)模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)病理學(xué)觀察，在CCl4注射的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)代謝指標(biāo)及肝功能等指標(biāo)進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，明確各種病理改變發(fā)生的具體時(shí)間節(jié)點(diǎn)，以期為NASH 的病程進(jìn)展、病理機(jī)制研究和干預(yù)治療提供可靠的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠52 只，8 周齡，體質(zhì)量為（22.37±1.21）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0011]。小鼠飼養(yǎng)于上海同濟(jì)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2018-0034]，溫度約24 ℃，濕度約60%，小鼠自由攝食和飲水，12 h 晝夜交替光照。

1.1.2 主要試劑及儀器 WD 小鼠飼料（脂肪含量21.1%、蔗糖含量41.0%、膽固醇含量1.3%）購自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，普通小鼠飼料購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，CCl4（批號(hào)為180720）購自上海試一化學(xué)試劑有限公司，葡萄糖（貨號(hào)為G8270）、果糖（貨號(hào)為F0127）、油紅O 染液（貨號(hào)為O1391）購自Sigma（美國(guó)），檸檬酸鈉修復(fù)液（貨號(hào)為G1202）、蘇木精染液（貨號(hào)為G1004）購自武漢賽維爾生物科技有限公司，即用型正常山羊血清（貨號(hào)為AR0009）、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液（貨號(hào)為AR1108）購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB 顯色試劑盒（貨號(hào)為SK-4100）購自Vector Laboratories（美國(guó)），增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（貨號(hào)為2586）購自Cell Signaling Technology（美國(guó)），TdT 介導(dǎo)的脫氧核苷酸切口末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒（貨號(hào)為11684817910）購自Roche（瑞士），EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)為C10337）、TRIzol 試劑（貨號(hào)為15596026）購自Invitrogen（美國(guó)），SYBR 快速定量PCR 試劑盒（貨號(hào)為KM4101）購自KAPA（美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa（日本），Ⅰ型膠原（collagen Ⅰ）擴(kuò)增引物（上、下游序列分別為5'-CCAAGAAGACATCCCTGGGAAA-3' 和5'-TGCACGT- CATCGCACACA-3'）由上海生工生物工程股份有限公司合成。市售玉米油購自本地超市，均為同一品牌同一批次 產(chǎn)品。

全自動(dòng)生化分析儀（Au640，日本Olympus）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（LightCycler96，瑞士Roche）、血糖儀及試紙（YZB/USA 5059-2012，德國(guó)Bayer）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備方法 將52 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control group）和模型組（model group），對(duì)照組16 只，模型組36 只；適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，開始造模。對(duì)照組小鼠食用普通飼料和純凈水；模型組食用WD 飼料，飲用水含有23.1 g/L 果糖和18.9 g/L 葡萄糖。另外，模型組小鼠每周（飲食造模開始時(shí)即進(jìn)行首次注射）按每克體質(zhì)量0.2 μL 的劑量腹腔注射CCl4（按體積1:9 溶于玉米油中），對(duì)照組小鼠同時(shí)腹腔注射等體積的玉米油。

1.2.2 代謝及肝指數(shù)檢測(cè) 造模期間每周稱量小鼠體質(zhì)量，并記錄。分別于第4、8、12、16、20 周（本文中第n周均指第n 周末，即造模開始后n 周）處死6 只模型組小鼠和2 只對(duì)照組小鼠，于第24 周處死2 組余下的小鼠。小鼠處死前12 h 禁食，臨處死前稱量體質(zhì)量；用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動(dòng)物后，心臟取血；然后迅速取出肝臟，稱取肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.2.3 血糖及糖耐量檢測(cè) 空腹血糖檢測(cè)：造模前（第0周）以及造模后不同時(shí)間點(diǎn)（第8、16、24 周）檢測(cè)小鼠空腹血糖。檢測(cè)前1 日20 時(shí)開始禁食，禁食12 h 后，尾靜脈采血，用血糖儀檢測(cè)空腹血糖。葡萄糖耐量測(cè)定：造模后第24 周時(shí)進(jìn)行小鼠糖耐量檢測(cè)。小鼠禁食12 h，稱重記錄后測(cè)量空腹血糖值，然后以2 mg/g 的劑量腹腔內(nèi)注射葡萄糖溶液，用血糖儀測(cè)定注射后15、30、60、120 min 小鼠尾靜脈血的血糖水平。

1.2.4 血清生化檢測(cè) 小鼠心臟取血后，血液放置2 h，然后于4 ℃13 523×g 離心10 min，收集血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定第8、16、24 周小鼠血清中三酰甘油（TAG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT） 水平。

1.2.5 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè) 分離肝臟后留取相同部位的部分肝組織，分別制作冰凍切片和石蠟切片；冰凍切片用于油紅O 染色，石蠟切片用于天狼猩紅染色和蘇木精-伊紅（H-E）染色；然后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂肪堆積、膠原沉積和形態(tài)學(xué)變化的情況，并進(jìn)行肝組織病理學(xué)的等級(jí)評(píng)分。

每只小鼠選取3 張切片，200 倍鏡下，隨機(jī)觀察20 個(gè)視野，采用2005 年美國(guó)NASH 臨床研究工作組（Clinical Research Network，CRN）提出的標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行NAFLD 活動(dòng)度積分（NAFLD activity score，NAS）評(píng)定和肝纖維化評(píng)分，用于NASH 嚴(yán)重程度分級(jí)。

NAS 評(píng)定從3 個(gè)方面分別評(píng)分。①肝脂肪變性。顯微鏡下估計(jì)肝脂肪變性的面積：＜5%，0 分；≥ 5%且＜33%，1 分；≥ 33%且＜66%，2 分；≥ 66%，3 分。② 肝小葉炎癥。顯微鏡下計(jì)數(shù)有炎癥反應(yīng)的視野數(shù)：0 個(gè)，0 分；＜2 個(gè)， 1 分；≥ 2 個(gè)且＜4 個(gè)，2 分；≥ 4 個(gè)，3 分。③肝細(xì)胞氣球樣變性。無，0 分；少見，1 分；多見，2 分。3 項(xiàng)得分相加，總和1 ～2 分排除NASH，3 ～4 分為NASH 可能，5 ～8 分確診NASH。

CRN 系統(tǒng)對(duì)NASH 纖維化評(píng)分根據(jù)逐漸發(fā)展的纖維化進(jìn)程分為5 級(jí)，對(duì)應(yīng)評(píng)分0 ～4 期。①0 期：無纖維化。②1 期：竇周纖維化或門脈周圍纖維化。1 期又被細(xì)分為輕度3 區(qū)（中央靜脈周圍）竇周纖維化（1A 期）和重度3 區(qū)竇周纖維化（1B 期），以及僅有匯管區(qū)纖維化（1C 期）。③2 期：竇周纖維化合并匯管區(qū)周圍纖維化。④3 期：纖維橋形成。⑤4 期：肝硬化。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 制作石蠟切片后依次進(jìn)行烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)（檸檬酸鈉pH 6.0，微波加熱）、滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，經(jīng)山羊血清封閉后，4 ℃一抗孵育過夜，室溫孵育二抗，應(yīng)用生物素親和素放大信號(hào)后采用DAB 顯色法檢測(cè)肝組織中PCNA 的表達(dá)情況。每只小鼠選取3 張切片，400 倍鏡下選取5 個(gè)以上典型視野，計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 肝組織細(xì)胞凋亡的檢測(cè) TUNEL 法原位檢測(cè)肝組織切片細(xì)胞凋亡的情況。石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，用15 μg/mL 蛋白酶K 工作液于37 ℃孵育組織切片20 min，滴加TUNEL 反應(yīng)液進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)（37 ℃，60 min）后用POD 轉(zhuǎn)換液37 ℃孵育30 min，最后采用DAB 顯色法檢測(cè)。每只小鼠選取3 張切片，400 倍鏡下選取5 個(gè)以上典型視野，計(jì)算平均凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取部分肝組織，用TRIzol提取RNA 后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)肝組織中纖維化相關(guān)基因collagen Ⅰ的表達(dá)情況。PCR 反應(yīng)體系：2×FASTStart 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 5 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。利用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 和GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料用±s 表示，組間比較行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況

在造模過程中，對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)及生活習(xí)性正常，毛色光澤；而模型組小鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，皮毛日漸疏松且油膩，精神萎靡。對(duì)照組和模型組小鼠體質(zhì)量均逐漸增加，模型組小鼠體質(zhì)量稍高于對(duì)照組小鼠，但曲線下面積組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.507，圖1A）。模型組小鼠的空腹血糖曲線下面積與對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.592，圖1B）。第24 周時(shí)進(jìn)行小鼠葡萄糖耐量的測(cè)定，并計(jì)算曲線下面積來評(píng)價(jià)葡萄糖耐量的改變，結(jié)果顯示模型組較對(duì)照組葡萄糖耐量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.261，圖1C、D）。

圖1 造模過程中小鼠的代謝情況Fig 1 Metabolism of mice during modeling

2.2 肝臟變化及肝指數(shù)情況

采血后迅速分離肝臟，觀察可見對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，色澤鮮紅，質(zhì)韌，邊緣銳利；而模型組小鼠第8 周開始肝臟表面光澤變差，顏色偏黃白，有油膩感，邊緣變鈍（圖2）。稱量肝臟質(zhì)量后計(jì)算肝指數(shù)，結(jié)果顯示造模 8 周后肝指數(shù)即明顯增加，模型組第8、12、24 周肝指數(shù)與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表1）。

圖2 2 組小鼠肝臟照片F(xiàn)ig 2 Photos of mice livers in the two groups

表1 2 組小鼠肝指數(shù)比較Tab 1 Liver index comparison between the two groups

2.3 血清學(xué)指標(biāo)變化

小鼠取血后分離血清，分別檢測(cè)血清中GPT、GOT及TAG 的含量。結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比，血清GPT 和GOT 的含量明顯增高，第24 周時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表2）。與對(duì)照組相比，造模第8 周血清中TAG 含量增加不明顯，但造模第24 周時(shí)血清中TAG含量均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 2 組小鼠血清生化指標(biāo)的比較 Tab 2 Comparison of biochemical indexes between the two groups

2.4 肝組織H-E 染色與油紅O 染色分析

顯微鏡下可觀察到對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，除有少量細(xì)胞出現(xiàn)小泡性脂肪變性外，無氣球樣變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組第8 周時(shí)肝臟可見肝小葉結(jié)構(gòu)稍有紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性明顯較對(duì)照組增多，以小泡性脂肪變性為主；第16 周時(shí)肝細(xì)胞脂肪變性更加嚴(yán)重，為大、小泡混合型脂肪變性，夾雜部分氣球樣變肝細(xì)胞，且可見不同數(shù)量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀壞死灶；第24 周時(shí)肝細(xì)胞脂肪變性減輕，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉內(nèi)點(diǎn)灶性壞死等病變明顯加重（圖3A）。NAS 評(píng)定結(jié)果顯示，模型組第16 周和第24 周時(shí)平均NAS 均顯著高于對(duì)照組（均P=0.000），且平均評(píng)分均＞4 分（圖3B）。油紅O 染色結(jié)果顯示，模型組第8 周時(shí)可見肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量紅色脂滴，第16 周時(shí)肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)所含脂滴量達(dá)到高峰，到第24 周時(shí)脂滴有所減少（圖3A）。分析油紅O 染色面積，結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞中油紅O 染色面積均大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000，圖3C）。

圖3 2 組小鼠肝臟H-E 染色和油紅O 染色分析Fig 3 Analysis of H-E staining and oil red O staining of mice liver in the two groups

2.5 肝組織纖維化檢測(cè)結(jié)果

石蠟切片經(jīng)天狼猩紅染色后，鏡下觀察膠原的沉積情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝組織中未見肝纖維化；而模型組小鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織的纖維化程度逐漸加重，造模第8 周時(shí)僅有竇周纖維化或匯管區(qū)周圍纖維化（1 期），造模第16 周時(shí)出現(xiàn)竇周纖維化合并匯管區(qū)/匯管區(qū)周圍纖維化（2 期），造模第24 周時(shí)有纖維橋形成（3期）（圖4A）。分析膠原面積，模型組第16 周和第24 周肝組織的膠原面積顯著大于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，圖4B）。qPCR 結(jié)果顯示，隨著模型病程的進(jìn)展，纖維化相關(guān)基因collagen Ⅰ的表達(dá)逐漸增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，圖4C）。這些結(jié)果表明隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型小鼠肝臟向著纖維化方向不斷 進(jìn)展。

圖4 2 組小鼠肝臟纖維化檢測(cè)結(jié)果Fig 4 Detection results of liver fibrosis in the two groups

2.6 肝組織細(xì)胞凋亡和增殖檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用TUNEL 法檢測(cè)造模過程中肝組織細(xì)胞的凋亡情況，陽性表達(dá)主要見于細(xì)胞核，為棕黃色。對(duì)照組小鼠肝組織內(nèi)只有極個(gè)別TUNEL 陽性細(xì)胞。模型組第8 周時(shí)肝組織內(nèi)TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，陽性細(xì)胞以肝細(xì)胞為主，一些血竇細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也呈陽性；第16 周時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)量仍較多，散在分布于肝腺泡中，以脂肪變性嚴(yán)重及點(diǎn)狀壞死區(qū)域較多見，少數(shù)凋亡細(xì)胞內(nèi)可見殘留細(xì)胞空泡；第24 周時(shí)TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)有所下降（圖5A）。統(tǒng)計(jì)TUNEL 陽性肝細(xì)胞數(shù)，可見隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡的肝細(xì)胞在逐漸減少，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，圖5B）。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PCNA 表達(dá)情況，從而判斷肝細(xì)胞的增殖情況。PCNA 在細(xì)胞核表達(dá)，對(duì)照組小鼠肝組織有少量PCNA 表達(dá)陽性肝細(xì)胞；模型組第8 周時(shí)PCNA 陽性表達(dá)的細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，PCNA 表達(dá)陽性的肝細(xì)胞呈漸增的趨勢(shì)，以中央靜脈周圍及點(diǎn)灶壞死區(qū)內(nèi)多見，同時(shí)PCNA 也表達(dá)于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中（圖5A）。統(tǒng)計(jì)PCNA 陽性肝細(xì)胞數(shù)，可見隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，增殖的肝細(xì)胞在逐漸增多，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000，圖5C）。

圖5 TUNEL 法細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果和PCNA 表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果Fig 5 Results of the level of apoptosis by TUNEL and the level of PCNA by immunochemistry

3 討論

近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率不斷攀升。中國(guó)成人NAFLD 患病率為6%～ 27%（檢測(cè)方式有所不同），NAFLD 年發(fā)病率為3.4%～ 9.1%[6-8]。根據(jù)肝組織脂肪變性是否伴有炎癥反應(yīng)和纖維化，NAFLD 可分為NAFL、NASH 和NASH 相關(guān)肝硬化3 個(gè)階段[9]。既往研究[10]表明，在病程的NAFL 階段，只要積極給予干預(yù)，NAFLD 可以被逆轉(zhuǎn)；而NASH 是單純性脂肪肝向肝纖維化和肝硬化過渡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一旦進(jìn)展到NASH 階段，無論是否經(jīng)過肝硬化均可發(fā)展為肝癌[11]。構(gòu)建一個(gè)具備NASH 組織學(xué)特征且能同時(shí)反映NASH 向肝纖維化、肝癌進(jìn)展的模型對(duì)NASH 的分子機(jī)制研究和藥物開發(fā)顯得十分重要。

目前，國(guó)內(nèi)外用于科學(xué)研究的NAFLD 動(dòng)物模型主要包括基因敲除或基因突變模型、營(yíng)養(yǎng)或藥物誘發(fā)的模型及聯(lián)合應(yīng)用基因模型和營(yíng)養(yǎng)模型的復(fù)合模型3 種[12]，其中以高糖高脂飲食誘導(dǎo)最為常見[13-14]。但是這些模型大多只能反映NAFLD 病程的某個(gè)單一階段，能夠概括NAFLD 全病程的動(dòng)物模型并不多見。在既往研究[15]中，研究人員通過改進(jìn)膽堿缺乏飲食的方法建立了一種小鼠NASH 肝纖維化模型，但這種模型是由于膽堿缺乏導(dǎo)致脂質(zhì)代謝功能受損而引起NASH，與臨床發(fā)病機(jī)制不盡相同。本研究原本計(jì)劃參照既往報(bào)道的WD 聯(lián)合CCl4的方法[16]制造小鼠肝癌模型，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法無法制造肝癌模型，卻意外成功制造了小鼠NASH 模型。該造模方法中的飲食模式更符合人類的飲食習(xí)慣，該模型更接近臨床代謝性NASH 的疾病進(jìn)程。

含有高脂肪、高果糖（或蔗糖）和高膽固醇的WD 已被廣泛用于建立小鼠NASH 模型，這種飲食模式模擬了人們的快餐飲食習(xí)慣，與人類NASH 的發(fā)生有關(guān)；WD 不僅可以誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪變性，還可以誘導(dǎo)小鼠肥胖和胰島素抵抗[17-18]。然而，單用WD 誘導(dǎo)的NASH 模型即使經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間（25 ～52 周）的喂養(yǎng)仍不能使病程進(jìn)展到嚴(yán)重脂肪性肝炎和纖維化的階段[18-19]。因其耗時(shí)較長(zhǎng)，花費(fèi)較高，對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究來說并不是一個(gè)理想的動(dòng)物模型。長(zhǎng)久以來，CCl4都被用來誘導(dǎo)小鼠肝損傷和肝纖維化[20]，因其造模方便、時(shí)間短、成模率高的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但也因其死亡率高受到限制。然而研究表明，長(zhǎng)期慢性應(yīng)用CCl4誘導(dǎo)的模型首先出現(xiàn)3 區(qū)纖維化，而成人NASH 的纖維化也始于肝腺泡3 區(qū)，由膠原纖維和其他細(xì)胞外間質(zhì)纖維沿3 區(qū)的竇周和肝細(xì)胞分布[21]，因此CCl4可以很好地模擬人肝臟纖維化病理變化過程；另外，CCl4的應(yīng)用可以導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變性[22]，這是NASH 的典型病理變化之一。因此，我們聯(lián)合WD 和小劑量CCl4來構(gòu)建NASH模型，不僅極大縮短了單純WD 喂養(yǎng)的造模時(shí)間，而且很好地模擬了NASH 病理進(jìn)程，同時(shí)降低了大劑量CCl4造成的高死亡率。

在本研究中，我們還連續(xù)檢測(cè)了造模過程中肝臟組織的病理生理動(dòng)態(tài)變化，證實(shí)NAFLD 前期主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性，隨著炎癥和肝細(xì)胞損傷的出現(xiàn)，脂肪含量下降，晚期出現(xiàn)肝纖維化。之前也有研究[23]表明，隨著病程的延長(zhǎng)，肝臟脂肪含量的下降與NAFLD 向進(jìn)展性纖維化發(fā)展相關(guān)，至肝硬化階段肝脂肪變性可完全消退。同時(shí)，通過TUNEL 法我們檢測(cè)了NASH 病變過程中的細(xì)胞凋亡情況，證實(shí)細(xì)胞凋亡持續(xù)存在于NASH 的病變過程中，顯示細(xì)胞凋亡是NASH 進(jìn)展過程中重要的細(xì)胞損傷形式之一。從TUNEL 檢測(cè)結(jié)果看，凋亡肝細(xì)胞主要分布于脂肪變性嚴(yán)重的區(qū)域，個(gè)別陽性肝細(xì)胞胞質(zhì)中殘留脂肪空泡，這些結(jié)果都提示脂肪變性或許與凋亡具有相關(guān)性，可能因?yàn)橹|(zhì)的積累對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過PCNA 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在造模早期，肝細(xì)胞增殖并不明顯，隨著造模的推進(jìn)，肝細(xì)胞的增殖逐漸增多。綜合這些結(jié)果表明，在NASH 早期階段，肝細(xì)胞以凋亡為主，隨著NASH 病程的進(jìn)展，肝組織針對(duì)組織損傷的自我修復(fù)功能加強(qiáng)，表現(xiàn)為凋亡與增殖共同存在。另外，在一些點(diǎn)狀壞死灶區(qū)域、竇周浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞以及肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核中也可見PCNA 陽性表達(dá)，持續(xù)于整個(gè)病程，表現(xiàn)出NASH炎癥及纖維化的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。肝細(xì)胞增殖水平上升意味著細(xì)胞可能發(fā)生了異常增生，向肝癌進(jìn)展的可能性增加。但本研究中小鼠模型第24 周時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)肝癌結(jié)節(jié)和惡性增殖的肝細(xì)胞，而既往研究顯示利用同樣的方法構(gòu)建小鼠模型，造模第24 周時(shí)在部分小鼠中出現(xiàn)了肝細(xì)胞肝癌[16]，這種差別可能與采用不同廠家生產(chǎn)的飼料以及小鼠的個(gè)體差異有關(guān)。今后，可擴(kuò)大樣本、延長(zhǎng)飼養(yǎng)周期進(jìn)一步探討制造NASH 相關(guān)肝癌模型的可能性。

綜上所述，本研究采用WD 聯(lián)合小劑量CCl4的方法構(gòu)建了一種NASH 模型，該模型復(fù)制了NASH 的病理學(xué)特征（肝細(xì)胞脂肪變性、肝小葉炎癥、氣球樣變性）及NASH 發(fā)生過程中血清中轉(zhuǎn)氨酶的變化情況，并且基本體現(xiàn)了NAFLD 的自然進(jìn)程，從第8 周時(shí)的NAFL 進(jìn)展到第16 周時(shí)的NASH，再到第24 周時(shí)3 期纖維化的發(fā)生。該模型的成功構(gòu)建為研究NASH 和NASH 相關(guān)肝纖維化提供了可靠的模型工具小鼠，為今后研究NASH 的病理生理機(jī)制奠定了較好的研究基礎(chǔ)。

參·考·文·獻(xiàn)

[1] Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif D, et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes[J]. Hepatology, 2016, 64(1): 73-84.

[2] Fan JG, Kim SU, Wong VW. New trends on obesity and NAFLD in Asia[J]. J Hepatol, 2017, 67(4): 862-873.

[3] Wong RJ, Cheung R, Ahmed A. Nonalcoholic steatohepatitis is the most rapidly growing indication for liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma in the U.S[J]. Hepatology, 2014, 59(6): 2188-2195.

[4] Nakagawa H. Recent advances in mouse models of obesity- and nonalcoholic steatohepatitis-associated hepatocarcinogenesis[J]. World J Hepatol, 2015, 7(17): 2110-2118.

[5] Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease[J]. Hepatology, 2005, 41(6): 1313-1321.

[6] Fan JG. Epidemiology of alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease in China[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(Suppl 1): 11-17.

[7] Wang FS, Fan JG, Zhang Z, et al. The global burden of liver disease: the major impact of China[J]. Hepatology, 2014, 60(6): 2099-2108.

[8] Fan JG, Zhu J, Li XJ, et al. Prevalence of and risk factors for fatty liver in a general population of Shanghai, China[J]. J Hepatol, 2005, 43(3): 508-514.

[9] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)脂肪性肝病專家委員會(huì). 非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018 更新版)[J]. 傳染病信息, 2018, 31(5): 393-420.

[10] Yki-J?rvinen H. Nutritional modulation of non-alcoholic fatty liver disease and insulin resistance[J]. Nutrients, 2015, 7(11): 9127-9138.

[11] Bhala N, Angulo P, van der Poorten D, et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease with advanced fibrosis or cirrhosis: an international collaborative study[J]. Hepatology, 2011, 54(4): 1208-1216.

[12] 謝博文, 李蓓蕾, 胡鵬言, 等. 非酒精性脂肪性肝病動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J]. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 21(4): 65-67.

[13] Fakhoury-Sayegh N, Trak-Smayra V, Khazzaka A, et al. Characteristics of nonalcoholic fatty liver disease induced in wistar rats following four different diets[J]. Nutr Res Pract, 2015, 9(4): 350-357.

[14] Heeboll S, El-Houri RB, Hellberg YE, et al. Effect of resveratrol on experimental non-alcoholic fatty liver disease depends on severity of pathology and timing of treatment[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2016, 31(3): 668-675.

[15] 蓋曲倞, 董凌月, 安威. 非酒精性脂肪性肝炎及肝纖維化動(dòng)物模型的建立[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2016, 25(5): 562-565.

[16] Tsuchida T, Lee YA, Fujiwara N, et al. A simple diet- and chemical-induced murine NASH model with rapid progression of steatohepatitis, fibrosis and liver cancer[J]. J Hepatol, 2018, 69(2): 385-395.

[17] Machado MV, Michelotti GA, Xie G, et al. Mouse models of diet-induced nonalcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease[J]. PLoS One, 2015, 10(5): e0127991.

[18] Charlton M, Krishnan A, Viker K, et al. Fast food diet mouse: novel small animal model of NASH with ballooning, progressive fibrosis, and high physiological fidelity to the human condition[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2011, 301(5): G825-G834.

[19] Asgharpour A, Cazanave SC, Pacana T, et al. A diet-induced animal model of non-alcoholic fatty liver disease and hepatocellular cancer[J]. J Hepatol, 2016, 65(3): 579-588.

[20] Scholten D, Trebicka J, Liedtke C, et al. The carbon tetrachloride model in mice[J]. Lab Anim, 2015, 49(1 Suppl): 4-11.

[21] Kleiner DE, Makhlouf HR. Histology of nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis in adults and children[J]. Clin Liver Dis, 2016, 20(2): 293-312.

[22] Urtasun R, Lopategi A, George J, et al. Osteopontin, an oxidant stress sensitive cytokine, up-regulates collagen-I via integrin αvβ3engagement and PI3K/pAkt/NFκB signaling[J]. Hepatology, 2012, 55(2): 594-608.

[23] Brunt EM. Nonalcoholic steatohepatitis[J]. Semin Liver Dis, 2004, 24(1): 3-20.