水飛發(fā)炮制雄黃對(duì)斑馬魚幼魚急性毒性的實(shí)驗(yàn)研究

郭曉珊 陳丙春

摘要：目的：觀察雄黃斑馬魚幼魚急性毒性。方法：用高劑量170 mg/L，中劑量85 mg/L，低劑量42.5 mg/L的雄黃水溶液處理斑馬魚幼魚，觀察記錄魚的中毒情況（平衡、游動(dòng)、呼吸、體色變化）以及 24-144小時(shí)的死亡情況及開始死亡時(shí)間及死亡數(shù)目。結(jié)果： 在雄黃濃度為170mg/L時(shí)，其72小時(shí)干預(yù)的斑馬魚胚胎死亡過半數(shù)，所以雄黃的急性毒性LD50為170mg/L。

關(guān)鍵詞：雄黃; 斑馬魚幼魚; 急性毒性

雄黃，為我國常用的礦物類中藥。李時(shí)珍《本草綱目》曰：“雄黃入點(diǎn)化黃金用，故名黃金石”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為雄黃具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧等功效。雄黃最早入藥的記載為《神農(nóng)本草經(jīng)》，臨床應(yīng)用的歷史已有幾千年。自20世紀(jì)50年代以來，國內(nèi)醫(yī)者將含雄黃的復(fù)方制劑或單方用于治療血液系統(tǒng)疾病、惡性淋巴系統(tǒng)疾病甚至實(shí)體瘤，取得了明顯的治療效果。尤其是近年來其對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病和急性早幼粒細(xì)胞白血病表現(xiàn)出的良好治療效果得到了世界的廣泛關(guān)注，成為除了砒霜外砷類抗癌藥的又一新星，與砒霜比其低毒性更是備受關(guān)注。

雄黃可內(nèi)服外用，用途廣泛，很多中成藥處方包括一些經(jīng)典名方如安宮牛黃丸、牛黃解毒丸以及兒科常用中成藥至寶丸、小兒驚風(fēng)七厘散等含有雄黃。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國家標(biāo)準(zhǔn)中收載的含有雄黃的中成藥約200個(gè)。然而，毒副作用較強(qiáng)是雄黃應(yīng)用中面臨的主要挑戰(zhàn)。

近年來的研究結(jié)果顯示：有無機(jī)砷及其代謝產(chǎn)物能通過胎盤屏障損害胎兒的正常發(fā)育，吳文斌等研究發(fā)現(xiàn)雄黃對(duì)嚙齒類動(dòng)物及其胚胎胎仔發(fā)育的毒性很低，需要進(jìn)一步在非嚙齒類動(dòng)物身上試驗(yàn)證實(shí)。目前，雄黃對(duì)非嚙齒類動(dòng)物及其胚胎胎仔發(fā)育的毒性的研究還未見報(bào)道。

斑馬魚是目前研究藥物毒性實(shí)驗(yàn)的最直觀的理想模式動(dòng)物之一，因?yàn)槠浞敝晨欤佐~全身透明，可視性強(qiáng)。斑馬魚是一種小型熱帶魚。由于產(chǎn)卵量大、易收集、飼養(yǎng)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)， 現(xiàn)已成為一些毒理標(biāo)準(zhǔn)（ 如 OECD 和ISO 標(biāo)準(zhǔn)） 的推薦測(cè)試物種和研究發(fā)育生物學(xué)的理想模型。

1.材料 ?野生斑馬魚幼魚（3月齡）。

2.藥物及其配置

2.1 雄黃水飛炮制及配置雄黃溶液3個(gè)劑量組：取雄黃生品，精密稱定，置研缽中加0.5倍量的水，研磨5min至糊狀，再加40倍量的水?dāng)嚢?min，停置4min，傾取混懸液，下沉的粗粉繼續(xù)研磨，如此反復(fù)操作，直至手捻細(xì)膩、無亮星為止，合并各次混懸液，靜置10h以上，傾去上清液，過濾，將濾出物60℃以下恒溫干燥10h，即得炮制品。

2.2配置雄黃溶液3個(gè)劑量組：高劑量170 mg/L，中劑量85 mg/L，低劑量42.5 mg/L，為人臨床擬用劑量的100、50和25倍?？瞻讓?duì)照為純水。

3實(shí)驗(yàn)方法： 4組試劑分別處理4組健康的雌雄斑馬魚幼魚（3月齡），試驗(yàn)開始時(shí)連續(xù)觀察 8 小時(shí)，觀察記錄魚的中毒情況（平衡、游動(dòng)、呼吸、體色變化）以及 24-144小時(shí)的死亡情況及開始死亡時(shí)間及死亡數(shù)目。當(dāng)魚死亡時(shí)，立刻取出，觀察并記錄其體表特征和內(nèi)臟表面特征。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為 96小時(shí)，96小時(shí)后若仍有存活魚，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)至 7天。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

不同濃度雄黃對(duì)斑馬魚幼魚的影響

從本次實(shí)驗(yàn)可以看出，在雄黃濃度為170mg/L時(shí)，其72小時(shí)干預(yù)的斑馬魚幼魚死亡過半數(shù)，所以雄黃的急性毒性LD50為170mg/L。

5.討論：

由此可見，水飛法炮制雄黃對(duì)斑馬魚幼魚的急性毒性LD50為170mg/L。

雄黃的炮制方法有干研法，水飛法，煮法，熬法，油熬法，復(fù)制法，火飛法等，而以干研法和水飛法最為常用。雄黃經(jīng)水飛成極細(xì)粉未，在反復(fù)操作中，As203就逐漸溶解去除。同時(shí)，雄黃中主要成分二硫化二砷不溶于水，故水飛對(duì)其沒有影響。實(shí)驗(yàn)證明：用水飛法除去As203是一個(gè)較好的方法。水飛時(shí)用水量越多，則As203含量就越低。當(dāng)用水量為1：125時(shí)、As203含量已接近lmg/g;1：250時(shí)，As203已降至0.21mg/g以下。

梁愛華等[2]在雄黃中 As2S2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，可溶性砷為1.696mg·g-1情況下，給小鼠單次灌胃給藥的 LD50為20.5g·kg-1（ 等于攝入可溶性砷 34.8mg·kg-1） ，相當(dāng)于人日用量約 12 812 倍。而給大鼠反復(fù)灌胃給藥時(shí)，雄黃超過一定劑量用藥達(dá)到 2 個(gè)月或以上時(shí)，可造成腎臟和肝臟病理損害，其中腎臟顯示更為敏感。大鼠灌胃雄黃 1，2，3 個(gè)月的無明顯毒性劑量（ NOAEL） 分別為 160，20，10 mg·kg-1·d-1（ 累積攝入可溶性砷8.14，2.04，1.53 mg·kg-1） 。估計(jì)臨床使用雄黃的相對(duì)安全劑量范圍為 10 ～160 mg（ 依用藥時(shí)間不同） 。結(jié)論： 反復(fù)使用雄黃時(shí)，建議在可溶性砷≤1.7mg·g-1的條件下，雄黃用藥 1～2 周時(shí)，劑量不超過 160 mg; 用藥 2～4 周時(shí)，劑量不超過 20mg;如果降低劑量至10mg 或以下，則在用藥 6 周內(nèi)相對(duì)安全。

雄黃具有一定的砷毒性，其毒性大小與炮制、加工、給藥劑量和給藥時(shí)間等密切相關(guān)。深入研究雄黃的毒性、安全劑量，為雄黃在臨床的應(yīng)用打下一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳文斌，湯家銘，祝曉雯，等. 中藥雄黃對(duì)孕大鼠母體和胚胎-胎仔發(fā)育的毒性[J].毒理學(xué)雜志，2009，23（ 5） ： 380-383.

[2]梁愛華，李春英，王金華，等.雄黃的毒性研究[J].中國中藥雜志，2011，36（14）： 1889-1894.

通訊作者：

陳丙春（1979年—），女，碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)。