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    FOS樣抗原1在頭頸鱗癌中的表達及臨床意義

    2020-07-04 04:33:48高曉琳修霞邱萍萍張杜合一謝舒樂林釗宇
    嶺南現(xiàn)代臨床外科 2020年3期
    關(guān)鍵詞:頭頸鱗癌免疫組化

    高曉琳,修霞,邱萍萍,張杜合一,謝舒樂,林釗宇

    頭頸鱗癌(head and neck squamous cell carci?noma,HNSC)位于全球最常見惡性腫瘤的第八位,每年新發(fā)病例超過55萬[1]。HNSC具有局部復發(fā)率高,易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點,臨床治療多采用以手術(shù)為主,輔以放化療或免疫療法,然而頭頸鱗癌患者的5年生存率仍低于50%[2,3]。FOS樣抗原1(FOS?like antigen 1,F(xiàn)OSL1)是FOS家族蛋白的成員,F(xiàn)OSL1和JunB家族蛋白形成異質(zhì)二聚體,共同組成腫瘤內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子——活化蛋白?1(activator protein?1,AP?1)[4]。目前研究證實FOSL1具有多種功能,如沉默F(xiàn)OSL1抑制了骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲;FOSL1抑制了Ⅰ型干擾素對瘧疾和病毒感染的反應[5,6]。然而,關(guān)于FOSL1蛋白在頭頸鱗癌中的表達及其作用的報道尚未發(fā)現(xiàn)。本研究通過查詢數(shù)據(jù)庫及免疫組化等方法檢測FOSL1在頭頸鱗癌患者的表達水平,并分析其臨床意義。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    收集中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院口腔頜面外科2010年3月至2014年8月根治性手術(shù)切除的頭頸鱗癌及其癌旁組織共98例。所有頭頸鱗癌患者術(shù)前均未接受放療或化療等治療。所有標本用4%多聚甲醛固定和石蠟包埋后制備4μm切片。所有患者均已被告知并簽署由本院倫理委員會批準的知情同意書。

    1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析

    通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html/)獲取FOSL1基因在頭頸鱗癌內(nèi)的表達及預后情況,通過Expression選項中sample type、tumor grade、gender等分類預測FOSL1在HNSC中的表達情況;通過Survival模式,以中位數(shù)為cut?off,預測FOSL1表達與HNSC患者的生存曲線圖。

    1.3 免疫組化

    二甲苯及梯度酒精常規(guī)脫蠟,pH6.0枸櫞酸微波修復20 min,自然冷卻至室溫。3%H2O2避光孵育15 min,滴加FOSL1一抗(Santa Cruz公司,sc?28310,1∶500)4℃孵育過夜,PBS漂洗后滴加抗鼠IgG二抗(基因科技公司,GK500710)37℃孵育30 min,PBS漂洗后滴加DAB顯色劑,蘇木素染核,脫水后樹膠封片。光學顯微鏡下觀察結(jié)果FOSL1的表達情況。

    1.4 免疫組化結(jié)果評判

    FOSL1的表達主要位于細胞核內(nèi),在高倍鏡下隨機選取5個視野,計算陽性細胞的百分比:0分是陽性細胞數(shù)<5%,1分是陽性表達細胞數(shù)5%~24%,2分是陽性表達細胞數(shù)為25%~49%,3分是陽性表達細胞數(shù)為50%~74%,4分是陽性表達細胞數(shù)≥75%;同時評判染色深度:0分是不著色,1分是淡黃色,2分是棕黃色,3分是棕褐色。最后兩項得分相乘,0~3分的標本判定為低表達,4~12分的標本判斷為高表達。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,分析FOSL1蛋白表達與患者臨床病理指標之間的關(guān)系采用卡方檢驗。采用Kaplan?Meier法進行生存分析,繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫獲取FOSL1在頭頸鱗癌中的表達

    通過UALCAN數(shù)據(jù)庫,我們基于sample type、tumor grade、HPV status和nodal metastasis status等分類對比了FOSL1在HNSC組織的表達。我們發(fā)現(xiàn)FOSL1在頭頸鱗癌中的表達顯著高于癌旁組織(P=0.039)(圖1A)。其次,不同病理分級HNSC中FOSL1的表達均比癌旁組織高,其中Grade 2(intermediate grade)和Grade 4(high grade)HNSC中FOSL1顯著升高(P<0.001)。不同病理分級HNSC組織內(nèi)FOSL1的表達呈顯著差異:Grade 1?vs?Grade 2(P=0.032),Grade 1?vs?Grade 4(P<0.0001),Grade 2?vs?Grade 3(P=0.0106),Grade 2?vs?Grade 4(P<0.0001),Grade 3?vs?Grade 4(P<0.0001)(圖 1B)。HPV陽性HNSC患者(p16&ISH檢測)中FOSL1的表達顯著低于HPV陰性患者(P<0.001)(圖1C)。此外,數(shù)據(jù)顯示與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(N0)相比,僅有N3組HNSC患者(>10個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)中FOSL1表達顯著升高(P=0.0017),而N1組較N3組亦顯著升高(P=0.0012)(圖1D)。

    2.2 免疫組化檢測FOSL1蛋白在頭頸鱗癌標本中的表達

    我們發(fā)現(xiàn)FOSL1蛋白主要定位于細胞核內(nèi)。FOSL1在癌旁組織內(nèi)的陽性率僅為8.1%(8/98),且FOSL1表達呈弱陽性,而大部分癌旁組織FOSL1表達為陰性。然而FOSL1在頭頸鱗癌樣本中均有表達,其中54例(55.1%)頭頸鱗癌FOSL1呈高表達(強陽性),44例(44.9%)頭頸鱗癌FOSL1呈低表達(弱陽性)(圖2A~D)。

    圖1 UALCAN數(shù)據(jù)庫檢測FOSL1蛋白在HNSC中的表達

    圖2 頭頸鱗癌及癌旁組織內(nèi)FOSL1的表達(免疫組化,×200)

    2.3 FOSL1的表達與頭頸鱗癌患者臨床病理指標的關(guān)系

    FOSL1表達與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理分化程度顯著相關(guān)(P<0.05),即高表達FOSL1的頭頸鱗癌患者的腫瘤直徑更大、分化程度更差、臨床分級更高,易發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而FOSL1表達水平與患者性別、年齡、遠處轉(zhuǎn)移等指標無明顯相關(guān)性(P>0.05),結(jié)果見表1。

    2.4 FOSL1 的表達對頭頸鱗癌患者預后的影響

    UALCAN數(shù)據(jù)庫顯示高表達FOSL1的HNSC患者較低表達HNSC預后差,兩組之間具有顯著差異(P=0.035)(圖3A)。此外,我們通過Kaplan?Meier法分析FOSL1表達對98例HNSC患者(本院收集)預后的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中FOSL1低表達組的頭頸鱗癌患者中位生存時間為96個月,F(xiàn)OSL1高表達組的頭頸鱗癌患者中位生存時間為42個月,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3B。

    3 討論

    目前AP?1蛋白被認為調(diào)控腫瘤、哮喘和類風濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,它會響應細胞因子、激素和生長因子等各種外界刺激,調(diào)控下游基因的表達繼而影響細胞的增殖、分化、凋亡等生物學過程[7,8]。AP?1是一種由Jun家族蛋白和Fos家族蛋白形成的高度保守的同源或者異源二聚體復合物,其中FOSL1屬于FOS蛋白家族的一員,它與Jun家族蛋白形成異源二聚體是眾多AP?1 復合物中最為穩(wěn)定的[8,9]。研究表明,AP?1主要通過FOSL1調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶家族降解細胞外基質(zhì),進而腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[7,8]。例如,在人結(jié)直腸癌細胞HT?29中AP?1結(jié)合在MMP7的DNA啟動子區(qū),促進腸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[10]。此外,F(xiàn)OSL1的調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾的水平,而蛋白水平的磷酸化是FOSL1調(diào)控翻譯后修飾的主要方式[8-10]。FOSL1主要由絲裂原活化蛋白激酶信號途徑調(diào)控,并被泛素非依賴性蛋白酶體降解[11]。此外,F(xiàn)OSL1可影響腫瘤的增殖、分化、侵襲和凋亡等生物學功能[4-6,11,12]。研究表明,F(xiàn)OSL1在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、鼻咽癌等腫瘤中過表達,而在宮頸癌和卵巢癌中的表達降低,在頭頸鱗癌中的表達仍存在爭議[11?14]。

    表1 FOSL1蛋白表達與頭頸鱗癌臨床病理特征的相關(guān)性(n)

    圖3 FOSL1的表達與頭頸鱗癌患者的預后

    目前生物大數(shù)據(jù)庫在細胞生物學的研究中發(fā)揮了舉足輕重的作用,UALCAN整合了TCGA和MET500來源的數(shù)據(jù),用于比較某一基因在特定腫瘤和正常組織、不同病理分類的腫瘤之間和不同類型正常組織內(nèi)的表達情況,同時還可以基因間的共表達分析、藥物敏感性基因篩查等[15]。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)FOSL1在頭頸鱗癌中顯著高表達,且FOSL1高表達與HNSC患者預后差顯著相關(guān)(P<0.05)。此外,F(xiàn)OSL1的表達與HNSC患者的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV狀態(tài)密切相關(guān)(P<0.05)。

    隨后我們通過免疫組化驗證FOSL1蛋白在頭頸鱗癌及癌旁組織中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOSL1在絕大多數(shù)頭頸鱗癌中均有表達,且頭頸鱗癌組織中FOSL1的表達顯著高于癌旁組織。通過卡方檢驗分析,我們發(fā)現(xiàn)FOSL1的表達與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV狀態(tài)及病理分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)。Kaplan?Meier分析表明高表達FOSL1的頭頸鱗癌患者生存率明顯低于低表達FOSL1的頭頸鱗癌患者。以上結(jié)果與數(shù)據(jù)庫預測的結(jié)果基本一致。本研究顯示FOSL1蛋白在頭頸鱗癌中顯著上調(diào),且與頭頸鱗患者臨床特征及預后密切相關(guān),提示FOSL1可能在頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用,它可以作為評估頭頸鱗癌患者預后的指標。

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