基于Fe3O4-PGA@Au 構(gòu)建無酶電化學(xué)生物傳感器檢測葡萄糖

關(guān)樺楠，龔德狀，宋 巖，劉 博，韓博林，楊 帆，崔琳琳，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

目前，用于葡萄糖檢測的電化學(xué)生物傳感器多依賴于其核心元件葡萄糖氧化酶的活性[1-3]。葡萄糖氧化酶為天然蛋白質(zhì)酶，可特異性催化底物葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫。通過測定催化反應(yīng)過程中電子遷移所產(chǎn)生的電信號構(gòu)建葡萄糖檢測的電化學(xué)生物傳感器[1]。但是葡萄糖氧化酶成本較高，穩(wěn)定性較差且固載技術(shù)復(fù)雜，使得此類型的生物傳感器應(yīng)用時(shí)受到一定的限制[4]。

近年來，伴隨著納米模擬酶研究的發(fā)展，模擬酶已成為催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-8]。相比于天然酶，納米模擬酶具有成本低、穩(wěn)定性高、可循環(huán)使用和催化活性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。在新興的葡萄糖氧化酶納米模擬酶中，金屬硫化物（MoS2）[9]、金屬氧化物（Co3O4、V2O5、CeO2和Mn3O4）[5]、碳納米材料（石墨烯、富勒烯和碳納米管）[7]、磁性粒子（Fe3O4）[10-12]和貴金屬粒子（Au、Ag和Pt）[12-14]吸引了諸多學(xué)者的關(guān)注；其中，磁性納米材料以其易回收和可循環(huán)利用的特點(diǎn)與具有良好催化活性的貴金屬納米材料相結(jié)合，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[12-15]。

圖1 Fe3O4-PGA@Au 納米材料的制備過程（A）和電極修飾及檢測葡萄糖原理示意圖（B）Fig. 1 Schematic illustration of Fe3O4-PGA@Au nanocomposite fabrication process (A), electrode modi fication and electrooxidation of glucose (B)

本研究中，采用聚谷氨酸（poly-(γ-glutamic acid)，PGA）作為還原劑和交聯(lián)劑，一步法自組裝制備具有核殼結(jié)構(gòu)的新型金磁微粒（Fe3O4-PGA@Au），具體過程如下：采用天然PGA綠色還原法制備Fe3O4-PGA微粒（圖1A-a），利用柑橘提取液綠色制備金納米粒子，并通過自組裝技術(shù)制備Fe3O4-PGA@Au納米粒子（圖1A-b）。PGA是一種水溶性多聚氨基酸，其結(jié)構(gòu)為谷氨酸單元通過α-氨基和γ-羧基形成肽鍵的高分子聚合物，具有很強(qiáng)的生物相容性[16-18]。通過PGA的交聯(lián)作用，此粒子結(jié)合了磁性粒子和貴金屬納米粒子的優(yōu)勢，具有良好的模擬酶催化活性、高穩(wěn)定性和易回收的特點(diǎn)，可催化底物葡萄糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)。采用新型金磁微粒修飾玻碳電極，構(gòu)建了葡萄糖檢測的無酶型電化學(xué)生物傳感器（圖1B-c），所獲得的傳感器針對葡萄糖表現(xiàn)出良好的電催化性能，在催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫的過程中形成明顯的電化學(xué)氧化峰（圖1B-d）。該類型無酶傳感器表現(xiàn)出良好的靈敏度，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果將為食品、藥品和環(huán)境成分檢測與分析技術(shù)的改良提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水氯化鐵、三水乙酸鈉、PEG-4000、葡萄糖天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；PGA、氯金酸 美國Sigma公司；葡萄糖檢測試劑盒 上海市德賽診斷系統(tǒng)有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MAGNA-IR560E.S.P傅里葉變換紅外光譜儀 美國ULVCA-PHI公司；BT-9300H激光粒度分布儀 美國惠普公司；9600振動磁強(qiáng)計(jì) 美國LDJ Electronics公司；CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中國上海申順生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4-PGA@Au的制備與表征

金納米粒子的制備參考本課題組前期工作[19]，采用橘皮提取液快速合成。Fe3O4-PGA微粒采用一步綠色水熱還原法制備，具體流程如下：稱量0.8 g的FeCl3·6H2O粉末和0.1 g的PGA粉末，分散于60 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min；將整個(gè)體系移至水熱反應(yīng)釜中，在180 ℃條件下反應(yīng)6 h；將反應(yīng)得到的黑色懸浮液分別用乙醇和去離子水清洗2 次，70 ℃條件下真空干燥5 h，獲得的黑色粉末即為Fe3O4-PGA。采用去離子水配制Fe3O4-PGA粒子懸浮溶液（100 mg/mL），向20 mL懸浮溶液中加入20 mL金納米粒子溶膠，渦旋振蕩2 min；用磁鐵在側(cè)壁吸附固定體系中的固體，棄去上清液，采用去離子水清洗固體2 次，冷凍干燥，即獲得Fe3O4-PGA@Au；4 ℃保存，備用。采用振動磁強(qiáng)計(jì)測定Fe3O4-PGA@Au的磁學(xué)性質(zhì)，采用X射線衍射圖譜和傅里葉變換紅外光譜對合成的復(fù)合微粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.2 無酶葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建

采用金相砂紙拋光玻碳電極（GCE，直徑3 mm），在去離子水中超聲清洗20 min，然后將電極置于強(qiáng)酸混合液（硝酸-鹽酸-水（1∶3∶4，V/V））中浸泡10 min，再在去離子水中超聲清洗20 min。將預(yù)處理后的玻碳電極浸置于Fe3O4-PGA@Au懸浮溶液（100 mg/mL）中，靜置2 min（恒電位為3.0 V），使玻碳電極表面吸附有帶有負(fù)電荷的金磁微粒，再用去離子水柔和清洗玻碳電極，用以去除游離的雜質(zhì)；將吹干后的電極再次浸置于Fe3O4-PGA@Au懸浮溶液（100 mg/mL）中，靜置2 min，此為Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶型電化學(xué)生物傳感器，室溫靜置備用。

1.3.3 無酶生物傳感器檢測葡萄糖條件的優(yōu)化

電化學(xué)測定在CHI660e型電化學(xué)工作站上進(jìn)行，采用三電極體系：鉑電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，修飾的玻碳電極為工作電極。利用循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法測定無酶生物傳感器檢測葡萄糖時(shí)氧化峰電流，通過峰電流強(qiáng)度評估并優(yōu)化檢測體系的參數(shù)。分別考察檢測溫度、檢測時(shí)間、檢測pH值和掃描速率對檢測體系的影響。將1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到15 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.2）中，將Fe3O4-PGA@Au-GCE浸入反應(yīng)體系中，采用NaOH調(diào)節(jié)體系pH值為7.2～8.2，維持總體積16 mL，葡萄糖濃度為0.01 mmol/L，在不同水浴溫度條件下（30～55 ℃）孵育不同的時(shí)間間隔（5～30 min），設(shè)置不同的掃描速率（20～70 mV/s），根據(jù)結(jié)果篩選最佳檢測參數(shù)。

1.3.4 葡萄糖的檢測

使體系中葡萄糖濃度分別為0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0 μmol/L和100.0 μmol/L，采用Fe3O4-PGA@Au-GCE，根據(jù)優(yōu)化后的體系參數(shù)，利用CV法檢測不同濃度葡萄糖的峰電流強(qiáng)度，觀察CV曲線變化。將峰電流強(qiáng)度換算為峰電流密度（即玻碳電極表面有效單位面積的電流強(qiáng)度（Id，μA/cm2），以峰電流密度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度（C，μmol/L）為橫坐標(biāo)構(gòu)建工作曲線，其中葡萄糖濃度分別設(shè)置為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、250.00、500.00 μmol/L和1 000.00 μmol/L；選擇食品中常見的糖類作為參照（0.1 mmol/L，高于對照樣品中葡萄糖濃度10 倍），評估葡萄糖（0.01 mmol/L）檢測體系的抗干擾性能；測定葡萄糖0.01 mmol/L和0.1 mmol/L兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，采用所構(gòu)建的工作曲線確定該體系的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 實(shí)際樣品的檢測

選擇常見水果（紅富士蘋果和臍橙）作為實(shí)際樣品模型，并對樣品進(jìn)行必要的前處理。將水果樣品分別去皮去籽后，充分粉碎攪拌至糊狀；再取該糊狀樣品1 g加入到20 mL錐形瓶中，并加入雙蒸水10 mL，超聲振蕩15 min后，離心去沉淀，將上清液用的微孔濾膜過濾（0.45 μm）一次；采用葡萄糖檢測試劑盒測定初始葡萄糖濃度；再向樣品上清液中添加不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.1、0.5、1.0 mmol/L），采用Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶傳感器測定其電化學(xué)行為，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次。基于所構(gòu)建的工作曲線計(jì)算實(shí)際樣品體系中的葡萄糖終濃度，考察檢測體系對實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，采用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe3O4-PGA@Au的表征

圖2 納米粒子的透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig. 2 TEM images of Fe3O4-PGA nanoparticles (A and B), gold nanoparticles (AuNPs) (C) and Fe3O4-PGA@Au nanoparticles (D)

由圖2A、B可知，制備的Fe3O4-PGA粒子平均粒徑約為290 nm，呈現(xiàn)近似圓球形的顆粒；在黑色的Fe3O4核心外壁包覆有一層透明薄膜，厚度約為10 nm，初步判斷為PGA層。金納米粒子的透射電子顯微鏡圖見圖2C，金納米粒子粒徑約為4 nm，多由圓球型和圓棒型粒子組成。由圖2D可知，在Fe3O4-PGA粒子透明層表面吸附有大量的金納米粒子。Fe3O4-PGA@Au微粒的X射線衍射、傅里葉變換紅外光譜和磁學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。

從圖3A可知，基于JCPDS 19-0629卡，衍射峰（111）和（311）對應(yīng)Au；衍射峰（220）、（311）、（400）、（511）、（422）和（440）對應(yīng)Fe3O4，說明Fe3O4-PGA@Au微粒中含有Au和Fe3O4。其中，（111）和（311）對應(yīng)的衍射峰2θ為38.56°和77.58°[20-22]。Fe3O4衍射峰所對應(yīng)的2θ為30.17°、35.54°、43.27°、53.62°、57.11°和62.85°，表明微粒中的Fe3O4為立方反尖晶石結(jié)構(gòu)，具備良好的電磁性能[23]。

Fe3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au的傅里葉變換紅外光譜圖譜見圖3B，F(xiàn)e3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au兩種微粒在578 cm-1處都出現(xiàn)Fe—O振動的吸收峰；同時(shí)，在1 610、1 659 cm-1和2 938 cm-1處都出現(xiàn)吸收峰，分別對應(yīng)C＝C、C＝O和C—H鍵，這幾個(gè)化學(xué)鍵都來自于PGA的制備和修飾[16,24]。此外，F(xiàn)e3O4-PGA在3 457 cm-1處具有明顯的吸收峰，對應(yīng)氨基基團(tuán)中的N—H，PGA作為一種天然的多聚氨基酸具有豐富的氨基基團(tuán)[25]；而Fe3O4-PGA@Au中3 457 cm-1所對應(yīng)的N—H峰強(qiáng)度變?nèi)?，說明金納米粒子已通過氨基與Fe3O4-PGA充分吸附[25]。Fe3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au的磁學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，兩種納米粒子飽和磁化值分別為62.7 emu/g和42.3 emu/g，說明金納米粒子的吸附弱化了磁核的磁性。

圖3 Fe3O4-PGA@Au X射線衍射（A）和傅里葉紅外光譜（B）圖Fig. 3 X-ray diffraction pattern (A) and Fourier transform infrared spectrum (B) of Fe3O4-PGA@Au nanoparticles

2.2 Fe3O4-PGA@Au-GCE檢測體系的參數(shù)優(yōu)化

由圖4A可知，峰電流強(qiáng)度隨掃描速率逐漸增大，當(dāng)掃描速率超過50 mV/s后，峰電流強(qiáng)度逐漸下降，可能是較高的掃描速率時(shí)，修飾電極出現(xiàn)極化現(xiàn)象，形成暫態(tài)，影響了峰電流強(qiáng)度[26]。

從圖4B可知，檢測時(shí)間為15 min時(shí)，峰電流強(qiáng)度最高。此催化反應(yīng)的產(chǎn)物中含有過氧化氫，其自身可以水解產(chǎn)生微弱電流；長時(shí)間催化所積累的過氧化氫會干擾電極對葡萄糖的識別性能，進(jìn)而造成峰電流強(qiáng)度的下降。檢測葡萄糖的模擬酶的催化反應(yīng)需要在弱堿環(huán)境中完成；且當(dāng)體系中出現(xiàn)OH-時(shí)，葡萄糖分子易聚集于電極附近，降低葡萄糖氧化的活化能，使其更容易被氧化，因此設(shè)置pH值范圍為7.2～8.2[27]。從圖4C可見，當(dāng)檢測體系的pH值為7.8時(shí)，峰電流強(qiáng)度最高；當(dāng)pH值繼續(xù)升高，反應(yīng)受到抑制，峰電流強(qiáng)度開始下降。從圖4D可知，最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)溫度繼續(xù)提升，峰電流強(qiáng)度開始下降，原因可能是溫度過高會造成電極表面金磁微粒的基底效應(yīng)，引致修飾層的剝離，影響了峰電流強(qiáng)度[28]。綜上，選擇最佳檢測條件為掃描速率50 mV/s、檢測時(shí)間15 min、pH 7.8和反應(yīng)溫度40 ℃。

圖4 掃描速率（A）、檢測時(shí)間（B）、體系pH值（C）和反應(yīng)溫度（D）對Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶傳感器檢測葡萄糖的影響Fig. 4 Effect of scan rate (A), detection time (B), pH value (C) and reaction temperature (D) on detection of glucose using Fe3O4-PGA@Au-GCE non-enzymatic sensor

2.3 Fe3O4-PGA@Au-GCE檢測葡萄糖體系的構(gòu)建

基于優(yōu)化后的檢測體系，采用CV法評估葡萄糖無酶檢測體系的電化學(xué)響應(yīng)性能，并構(gòu)建葡萄糖檢測的工作曲線。由圖5可知，當(dāng)體系中沒有葡萄糖時(shí)，CV曲線沒有出現(xiàn)明顯的氧化峰和還原峰；當(dāng)體系中加入葡萄糖（0.1 μmol/L）時(shí)，在0.15 V處出現(xiàn)氧化峰，說明電極表面的金磁微?？梢蕴娲咸烟茄趸复呋趸咸烟撬猱a(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫，該過程形成電信號，出現(xiàn)氧化峰；當(dāng)體系中葡萄糖的濃度逐漸增大，氧化峰的電流強(qiáng)度也逐漸提高[29-30]，葡萄糖濃度為100 μmol/L時(shí)，峰電流強(qiáng)度達(dá)到最大值-27.3 μA。由圖5可知，葡萄糖濃度C與峰電流密度Id在兩段濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，與其他的研究類似[12,29]。在葡萄糖濃度范圍為0.1～5.0 μmol/L時(shí)，峰電流密度回歸方程為Id=2.95C+57.37，R2=0.978 5；在10～250 μmol/L時(shí)，峰電流密度回歸方程為Id=0.118 9C+81.61，R2=0.984 5，檢出限為0.74 μmol/L（RSN=3）。結(jié)果表明，回收率在96%～107%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%～5%之間，符合檢測要求（12%以下）[30]。采用Fe3O4-PGA@Au-GCE所構(gòu)建的無酶葡萄糖檢測傳感器具有較高的靈敏度和重復(fù)性。

圖5 修飾電極對不同濃度葡萄糖的響應(yīng)Fig. 5 Response of Fe3O4-PGA@Au-GCE to different concentrations of glucose

選擇4 種常見糖類作為干擾物質(zhì)評估無酶葡萄糖檢測生物傳感Fe3O4-PGA@Au-GCE器的檢測特異性。由圖6可知，濃度皆為0.1 mmol/L的乳糖、麥芽糖、果糖和蔗糖氧化峰的峰電流強(qiáng)度均在5 μA以下，與此同時(shí)，0.01 mmol/L的葡萄糖峰電流強(qiáng)度超過20 μA，說明該生物傳感器具有選擇性檢測葡萄糖的性能。

圖6 Fe3O4-PGA@Au-GCE選擇性檢測葡萄糖Fig. 6 Selectivity of Fe3O4-PGA@Au-GCE toward glucose versus other tested sugar

2.4 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶型葡萄糖生傳感器在檢測純水中葡萄糖的過程中表現(xiàn)出了良好的性能，為拓寬其應(yīng)用范圍，需考察傳感器在實(shí)際樣品檢測中的相關(guān)表現(xiàn)。向不同種類的純果汁中的添加不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再利用所制備的無酶傳感器進(jìn)行測定，根據(jù)葡萄糖工作曲線獲得葡萄糖濃度，結(jié)果見表1。在蘋果汁和柑橘汁中，無酶傳感器檢測實(shí)際樣品中葡萄糖回收率為99%～101%，且組內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.3%，說明此類型無酶傳感器在實(shí)際樣品檢測中，具有良好精密度和重復(fù)性。

表1 實(shí)際樣品中葡萄糖含量的分析Table 1 Analytical results of glucose contents in real samples

3 結(jié) 論

本研究采用天然PGA綠色制備Fe3O4-PGA@Au，并利用金磁微粒優(yōu)良的模擬酶催化性能替代葡萄糖氧化酶構(gòu)建無酶型葡萄糖檢測生物傳感器。該粒子良好的分散性和催化活性，使修飾的電極檢在測葡萄糖的過程中呈現(xiàn)出較好的靈敏度和重復(fù)性。目前該粒子已被諸多研究成果證實(shí)具有多種天然酶的模擬酶性質(zhì)，可將其拓展于其他酶生物傳感器的構(gòu)建研究。此類無酶型生物傳感器可以克服復(fù)雜的環(huán)境刺激，用于極限條件下各類成分的分析，將為人體樣品、食品、藥品和環(huán)境組分檢測技術(shù)的改良提供基礎(chǔ)資料。