牙齦卟啉單胞菌在食管癌變過(guò)程中的作用研究

孟倩倩，原 翔，劉怡文，楊海軍，張耀文，劉安祥，高社干，周福有

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)為寄居于口腔牙齦上皮細(xì)胞內(nèi)的厭氧菌，該病原菌的生長(zhǎng)會(huì)影響整個(gè)口腔微生態(tài)的平衡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。慢性炎癥與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，Pg生長(zhǎng)引發(fā)的長(zhǎng)期炎癥可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[1]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)Pg感染與食管鱗癌的相關(guān)性[2]，對(duì)其促癌機(jī)制也進(jìn)行了相應(yīng)研究[3-4]，但尚無(wú)Pg感染促進(jìn)食管癌變過(guò)程的直接證據(jù)。作者針對(duì)Pg感染在食管癌前病變進(jìn)展為食管癌過(guò)程中的作用，進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2007年2月至2012年12月在安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院(河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院)經(jīng)內(nèi)鏡活檢病理診斷為食管癌前病變的患者73例，隨訪5 a后再次行內(nèi)鏡活檢病理檢查，按5 a后病理診斷結(jié)果分為兩組：5 a后進(jìn)展為食管鱗癌者為觀察組(33例)，5 a后仍為癌前病變者為對(duì)照組(40例)。本研究經(jīng)過(guò)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 研究材料Pg抗兔單克隆抗體(abcam公司)，SP超敏試劑盒(中杉金橋)，蘇木素染液、中性樹膠(邁新生物公司)，其他試劑(索萊寶公司)。多功能酶標(biāo)儀、冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、烤片機(jī)、攤片機(jī)(美國(guó)萊卡公司)，顯微鏡(日本Nikon公司)，渦旋振蕩器(美國(guó)Eppendorf公司)。

1.3 方法所有食管病變石蠟組織4 μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉菌抗生素蛋白—過(guò)氧化物酶連接法(SP法)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，測(cè)定食管病變組織樣本中Pg的表達(dá)情況。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野觀察(×200)，按照組織切片的染色強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行半定量分析，具體的標(biāo)準(zhǔn)如下：①染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞未染色者為陰性，計(jì)為0分；細(xì)胞染色較弱，呈淺黃色者為弱陽(yáng)性，計(jì)為1分；細(xì)胞染色結(jié)果呈棕黃色者為中度陽(yáng)性，計(jì)為2分；細(xì)胞染色較強(qiáng)，呈棕褐色者為強(qiáng)陽(yáng)性，計(jì)為3分。②染色面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞率≥0%且<5%，計(jì)為0分；陽(yáng)性細(xì)胞率≥5%且<25%，計(jì)為1分；陽(yáng)性細(xì)胞率≥25%且<50%，計(jì)為2分；陽(yáng)性細(xì)胞率≥50%且<75% ，計(jì)為3分；陽(yáng)性細(xì)胞率≥75%，計(jì)為4分。③免疫組化總分=染色強(qiáng)度評(píng)分乘以染色面積評(píng)分，總分0分表示陰性(-)；總分≥1分表示陽(yáng)性。

2 結(jié)果

觀察組中5 a前Pg感染陽(yáng)性率42.40%，免疫組化評(píng)分6.33；5 a后Pg感染陽(yáng)性率54.50%，免疫組化評(píng)分10.17。5 a后Pg感染陽(yáng)性率增加了12.10%，組內(nèi)免疫組化評(píng)分比較P=0.034，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組在5 a前Pg感染陽(yáng)性率40.00%，免疫組化評(píng)分2.93；5 a后Pg感染陽(yáng)性率45.00%，免疫組化評(píng)分7.77。5 a后Pg感染陽(yáng)性率增加了5.00%，組內(nèi)免疫組化評(píng)分比較P=0.038，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5 a前觀察組患者的Pg陽(yáng)性率高于對(duì)照組，觀察組免疫組化評(píng)分也明顯高于對(duì)照組，組間免疫組化評(píng)分比較P=0.023，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5 a后觀察組患者的Pg陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，觀察組免疫組化評(píng)分也明顯高于對(duì)照組，組間免疫組化評(píng)分比較P=0.032，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1-4。

表1 兩組在5 a前、5 a后樣本中Pg的陽(yáng)性表達(dá)情況 例(%)

A：1例Pg感染陽(yáng)性患者5 a前的免疫組化結(jié)果；B：同一Pg感染陽(yáng)性患者5 a后的免疫組化結(jié)果；C：1例Pg感染陰性患者5 a前的免疫組化結(jié)果；D：同一Pg感染陰性患者5 a后的免疫組化結(jié)果。圖1 觀察組Pg免疫組化結(jié)果(×200)

A：1例Pg感染陽(yáng)性患者5 a前的免疫組化結(jié)果；B：同一Pg感染陽(yáng)性患者5 a后的免疫組化結(jié)果，C：1例Pg感染陰性患者5 a前的免疫組化結(jié)果；D：同一Pg感染陰性患者5 a后的免疫組化結(jié)果。圖2 對(duì)照組免疫組化結(jié)果(×200)

A：觀察組5 a前后Pg感染率情況；B：對(duì)照組5 a前后Pg感染率情況；C：觀察組及對(duì)照組5 a前后Pg感染率的比較。圖3 兩組5 a前后Pg感染率對(duì)比柱狀圖

A：觀察組5 a前、5 a后Pg免疫組化評(píng)分的比較；B：對(duì)照組5 a前、5 a后Pg免疫組化評(píng)分的比較；C：兩組5 a前Pg免疫組化評(píng)分的比較；D：兩組5 a后Pg免疫組化評(píng)分的比較。圖4 兩組5 a前后Pg免疫組化評(píng)分柱狀圖

3 討論

我國(guó)食管癌在病因和組織學(xué)發(fā)生等方面與西方顯著不同，全球每年新增50萬(wàn)例食管癌患者中，一半以上發(fā)生在中國(guó)；食管鱗癌是我國(guó)主要組織學(xué)類型，占95%；食管鱗狀上皮從正?！骷?jí)癌前病變(基底細(xì)胞過(guò)度增生、不典型增生、原位癌)→早期浸潤(rùn)鱗癌的多階段演進(jìn)過(guò)程是中國(guó)人食管鱗癌主要組織學(xué)發(fā)病模式[5]。影響食管癌發(fā)生的因素較多，吸煙、飲酒、食管黏膜損傷、人乳頭狀瘤病毒感染及遺傳均可能增加食管鱗癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

由于我國(guó)食管鱗癌的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，食管癌一級(jí)預(yù)防即病因?qū)W預(yù)防也無(wú)法實(shí)施，二級(jí)預(yù)防的“三早”(早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療)一直是我國(guó)食管癌防控的主要戰(zhàn)略。近年來(lái)細(xì)菌感染作為食管鱗癌病因?qū)W之一，研究工作取得較大進(jìn)展，Pg感染作為食管鱗癌的發(fā)病危險(xiǎn)因素的研究也逐漸增多，為下一步食管鱗癌的一級(jí)預(yù)防提供了思路。本研究探討Pg是否參與促進(jìn)食管癌變的過(guò)程，為Pg感染作為食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因子提供直接證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，觀察組的病變組織中5 a前、后Pg感染陽(yáng)性率和免疫組化評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，表明在食管癌前病變患者中，Pg感染陽(yáng)性者相比陰性者更易于進(jìn)展為食管鱗癌，進(jìn)一步驗(yàn)證Pg感染可能為食管癌的致病危險(xiǎn)因素之一，Pg感染可能參與了癌前病變進(jìn)展為食管癌的過(guò)程，增加了食管癌變的風(fēng)險(xiǎn)。Pg感染促進(jìn)食管癌變的可能機(jī)制：人體口腔與食管在解剖學(xué)結(jié)構(gòu)上相互連通，在組織結(jié)構(gòu)上均為鱗狀上皮組織，口腔上皮細(xì)胞感染的Pg可能會(huì)轉(zhuǎn)移寄居于機(jī)體的食管上皮組織，導(dǎo)致食管上皮細(xì)胞Pg感染；感染改變食管黏膜組織局部的微環(huán)境，影響微生物的分布比例，促進(jìn)食管黏膜組織發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)，加速局部組織的損傷，進(jìn)一步會(huì)影響細(xì)胞中抑癌基因和促癌基因的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，從而誘發(fā)食管鱗癌[6]。

作者前期研究也表明食管癌患者的正常黏膜組織與癌組織間的微生態(tài)菌群生物結(jié)構(gòu)存在顯著差異，腫瘤組織中Pg豐度顯著高于癌癥患者的正常黏膜組織和健康人的黏膜組織[7]，從而揭示了Pg可能會(huì)通過(guò)影響微生物群落與宿主相互作用而參與食管癌的發(fā)病過(guò)程。近期研究顯示，Pg會(huì)隨唾液進(jìn)入消化道，食管癌組織的Pg感染率明顯高于賁門癌及胃癌，也間接提示Pg在食管癌發(fā)病中作用的重要性[3,8]。本研究中所有5 a前Pg感染陽(yáng)性的患者在5 a后仍然為陽(yáng)性，一定程度上反映了機(jī)體的食管黏膜一旦感染Pg，單純依靠組織自身的防御免疫系統(tǒng)無(wú)法自行清除。本研究為今后研發(fā)抗Pg疫苗或清除Pg感染的方法來(lái)降低食管癌的發(fā)病率提供依據(jù)，為食管癌的預(yù)防提供了一個(gè)新的方向和視角。