鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳改善大鼠非酒精性脂肪肝特性研究

梁嬌嬌，顧瑞霞，陳大衛(wèi)，瞿恒賢，張臣臣，關(guān)成冉，馬文龍，張龍飛，陳春萌，肖麗霞

（揚州大學江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127）

0 引 言

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）作為世界范圍內(nèi)成人和兒童最常見的一種慢性肝病[1-2]，具有發(fā)病機制復雜、診斷困難以及引發(fā)心血管疾病等問題，使治療NAFLD 面臨巨大的挑戰(zhàn)。目前，飲食與運動干預是治療NAFLD 的最基本方法[3]。近年來，越來越多的研究表明，腸道微生物可能是聯(lián)系飲食與人體健康之間的橋梁，通過調(diào)節(jié)飲食的攝入狀況可以調(diào)控腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)，進而影響腸道中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和人體生理狀態(tài)。因此，通過益生菌干預腸道微生物的方法為治療NAFLD 提供了新的方向和思路。

已有研究表明，益生菌作為腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑能有效地改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)控小腸細菌過度生長，改善肝代謝功能[4-7]。如 Iacono 等[8]通過對 NAFLD 患者的腸道菌群培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者存在不同程度的腸道菌群失調(diào)。Ritze等[9]報道了鼠李糖乳桿菌對NAFLD 的保護作用，在高糖飲食誘導的NAFLD 模型小鼠中，鼠李糖乳桿菌干預能增加有益細菌數(shù)量，恢復腸屏障功能，減弱肝臟炎癥和脂肪變性。

牛乳作為益生菌的最佳天然載體，在發(fā)酵期間，不僅能利用脫脂乳中的營養(yǎng)物質(zhì)進行生殖代謝，還根據(jù)不同的培養(yǎng)條件，使得發(fā)酵乳的代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，為腸道菌群進行氨基酸、碳水化合物和膽汁酸等代謝活動提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[10-12]。Mahak 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌M-13 在燕麥粉中發(fā)酵72 h 后，活菌數(shù)達到14.4 log cfu/mL，乳酸含量增加，具有較強的代謝活性。Miao 等[14]報道了益生菌副干酪乳桿菌亞種經(jīng)72 h 長時間發(fā)酵可生產(chǎn)出最佳的抗菌藥物。但是，目前關(guān)于較長時間發(fā)酵乳在體內(nèi)的益生特性研究較少。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 72 h 發(fā)酵乳較17 h 含有豐富的風味物質(zhì)、氨基酸等有益物質(zhì)，且體外益生特性較也好于17 h 發(fā)酵。因此，為進一步驗證鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 干預對非酒精性脂肪肝大鼠的體內(nèi)益生作用，本文通過17 h 和72 h 制備的發(fā)酵乳對非酒精性脂肪肝大鼠進行干預，探討其通過調(diào)節(jié)大鼠血清中的生化指標、游離脂肪酸、活性氧及炎癥因子來改善大鼠非酒精性脂肪肝的特性，為益生菌功能開發(fā)和產(chǎn)品應(yīng)用性能強化提供指導意義。

1 實 驗

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301（Lactobacillus rhamnosushsryfm 1301），揚州大學江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室保藏。

1.1.2 動物及飼料

6 周齡 SPF 級 Wistar 雄性大鼠，40 只，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，大鼠飼養(yǎng)及實驗均在本院清潔級實驗動物室內(nèi)進行。

普通飼料（面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮26%、豆料20%、魚粉2%、骨粉2%）、高脂飼料（10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇和0.2%膽鹽和78.8%基礎(chǔ)飼料），由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供。

1.1.3 主要試劑

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）,南京建成生物工程研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒,上海華藍化學科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

5804R 型高速冷凍離心機,德國Eppendorf 公司；RM225 組織切片機，德國萊卡公司；Axiocam erc5s 型生物顯微鏡，德國Carl. Zeiss 公司；7020 型全自動生化分析儀，日本株式會社日立制作所；1510 酶標儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)

將保藏的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 按3%接種量接種到改良MRS 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)，活化3代。

1.2.2 灌胃樣品的制備

將活化三代的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 按3%接種量接種在發(fā)酵復原脫脂乳中發(fā)酵，分別發(fā)酵17 h 和72 h，采用平板計數(shù)法進行活菌計數(shù)，調(diào)整活菌數(shù)為109CFU/mL，4 ℃保藏備用。

1.2.3 動物分組及處理

圖1 大鼠分組及處理情況

1.2.4 樣品的采集與處理

于末次灌胃后，大鼠禁食不禁水12 h，毛細血管取血，37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育30 min，3 500×g 離心20 min分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ杆偃〕龈闻K，稱重，取0.5 cm3，放于4%多聚甲醛固定，存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.5 大鼠體重及飲食量

實驗期間每天稱量、記錄飼料剩余量，每周定期稱量、記錄各組大鼠體重。大鼠處死前測定空腹體重。計算食物效應(yīng)比（攝入每克食物造成的體重增加）。

1.2.6 觀察大鼠組織病理學變化

將固定于4%多聚甲醛溶液中的肝組織取出，進行石蠟包埋、切片、HE 染色等一系列操作，在光鏡下觀察肝組織的病變情況以及肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.7 指標檢測

由圖4可知，當荷葉發(fā)酵上清稀釋至200～4 000倍后，其對 Caco-2細胞的存活率無顯著性差異(P>0.05)。后續(xù)實驗選用200倍，即荷葉發(fā)酵上清濃度200 μg·mL-1測定細胞抗氧化活性。

1.2.7.1 測定血清中生化指標含量

TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、SOD 均由7020型日立全自動生化分析儀測定。

1.2.7.2 測定血清中游離脂肪酸（FFA）、活性氧（ROS）含量

FFA、ROS 采用酶聯(lián)免疫測定法，按照 ELISA 試劑盒操作說明書進行測定。

1.2.7.3 測定血清中細胞因子含量

TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、NF-κB、IL-1β采用酶聯(lián)免疫測定法，按照ELISA 試劑盒操作說明書進行測定。

1.2.8 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 軟件處理，采用均值±標準差表示，以單因素方差分析進行顯著性檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌hsryfm1301 發(fā)酵乳對大鼠體重及食物效應(yīng)比的影響

高脂飼料喂食8 周，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預4 周，對大鼠的體重和食物效應(yīng)比產(chǎn)生了重要的影響，如圖2所示。

圖2 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳對大鼠體重及食物效應(yīng)比的影響（n=10，x±sd）

如圖2（a）所示，在實驗初期各組大鼠初始體重無顯著差異（P＞0.05），體重約為216.00 g。隨著時間的延長，各組大鼠體重也隨之增加。經(jīng)過8 周喂食及益生菌干預后，Control 組、Model 組、L.1301-17 組和L.1301-72 組大鼠最終體重較初始體重分別增加了132.00 g、188.50 g、164.67 g、151.33 g。與 Model 組相比，L.1301-17 組和L.1301-72 組大鼠體重增加量顯著減少（P＜0.05），但L.1301-17 組和L.1301-72 組之間大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。進一步比較各組大鼠食物效應(yīng)比發(fā)現(xiàn)如圖2（b），L.1301-17 組和L.1301-72 組的食物效應(yīng)比均顯著低于Model 組（P＜0.05），但 L.1301-17 組和 L.1301-72 組之間食物效應(yīng)比同樣無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳對大鼠血清生化指標的影響

高脂飲食的攝入容易引起機體內(nèi)生化指標水平的升高，從而引發(fā)心血管疾病。鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后對大鼠血清中生化指標水平產(chǎn)生了一定的影響，如圖3、4所示。

圖3 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳對大鼠血清血脂的影響（n=10，x±sd）

由圖 3 所示，Model 組的 TC、TG 和 LDL-C 含量分別為 2.27 mmol/L、1.79 mmol/L、1.14 mmol/L，與Control 組相比顯著增加（P＜0.05）；HDL-L 含量為0.54 mmol/L，顯著低于Control 組（P＜0.05）。經(jīng)鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后，L.1301-17 組TC、TG 以及 LDL-L 含量分別為 2.11 mmol/L、1.47 mmol/L、1.07 mmol/L，與Model 組相比顯著降低（P＜0.05）；L.1301-72 組 TC、TG 以及 LDL-L 含量分別為2.06 mmol/L、1.47 mmol/L、1.03 mmol/L，相 較 于Model組顯著降低（P＜0.05）；L.1301-17組和L.1301-72組HDL-L 含量分別為0.60 mmol/L、0.60 mmol/L，與Model 組相比顯著增加（P＜0.05），但L.1301-17 組和L.1301-72 組兩者之間，TC、TG、HDL-L 和LDL-L 無顯著性差異（P＞0.05）。

由圖 4 所示，Model 組的 ALT、AST 含量分別為61.20 U/L、98.20 U/L，與 Control 組相比顯著升高（P＜0.05）；SOD 含量為24.9 U/mL，顯著低于Control組（P＜0.05）。經(jīng)鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預 后 ，L.1301-17 組 ALT、AST 含 量 為 54.20 U/L、87.20 U/L，相較于 Model 組均顯著降低（P＜0.05），L.1301-72 組 ALT、AST 含量顯著降低 Model 組（P＜0.05），分別為 50.60 U/L、86.40 U/L；但 L.1301-17 組和L.1301-72 組兩者之間，ALT、AST 無顯著性差異（P＞0.05）。同時，L.1301-72 組SOD 含量較Model 組相比顯著增加（P＜0.05），為51.28 U/mL；L.1301-17組 SOD 含量為 54.67 U/mL，與 L.1301-72 組相比顯著增加（P＜0.05）。

2.3 鼠李糖乳桿菌hsryfm1301 發(fā)酵乳對大鼠肝臟病變的影響

高脂飲食的攝入會對機體的肝臟造成嚴重的損傷，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后對機體的肝臟起到了一定的保護作用，如圖5所示。

如圖5 所示，Control 組大鼠肝臟組織無脂肪變性，肝細胞結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，具有明顯的細胞核；Model 組大鼠肝臟發(fā)生脂肪變性，肝細胞結(jié)構(gòu)破壞嚴重，界限模糊，脂肪堆積明顯，含有大量脂肪空泡；L.1301-17 組和L.1301-72 組大鼠肝臟發(fā)生脂肪變性現(xiàn)象，但與Model 組大鼠相比肝細胞脂肪堆積減少，脂肪空泡數(shù)量減少；L.1301-72 組與L.1301-17 組相比干預效果更佳，大鼠肝臟出現(xiàn)輕微脂肪變性現(xiàn)象，具有明顯的細胞核，少量的脂肪空泡。

圖4 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳對大鼠血清ALT、AST、SOD的影響（n=10，x±sd）

圖5 鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301 發(fā)酵乳對大鼠肝臟病變的影響（×100）

2.4 鼠李糖乳桿菌hsryfm1301 發(fā)酵乳對大鼠血清FFA、ROS的影響

FFA 和ROS 是導致肝損傷的重要物質(zhì)，高脂飼料的攝入引起機體內(nèi)FFA 和ROS 水平升高，鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后對大鼠體內(nèi)FFA 和ROS具有一定的調(diào)節(jié)作用，如圖6所示。

圖6 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳對大鼠血清FFA、ROS的影響（n=10，x±sd）

由圖 6 所示，與 Control 組相比，Model 組 FFA、ROS 含量顯著增加（P＜0.05），分別為1597.95 U/L、438.00 U/mL。經(jīng)鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后，L.1301-17 組 FFA、ROS 含量與 Model 組相比顯著降低（P＜0.05），分別為1442.14 U/L、405.40 U/mL；L.1301-72 組的 FFA、ROS 含量為 1188.68 U/L、339.88 U/mL，與Model 組相比顯著降低（P＜0.05）；L.1301-72 組 FFA、ROS 的含量與 L.1301-17 組相比顯著降低（P＜0.05），其中 L.1301-72 組和 Control 組之間FFA 含量無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 鼠李糖乳桿菌hsryfm1301 發(fā)酵乳對大鼠血清促炎因子的影響

TNF-α 、IL-6、IL-8 作為反映炎癥嚴重程度的重要指標，在肝細胞損傷發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。TGF-β1 是促進肝纖維化和細胞外基質(zhì)降解的重要因子，可誘導肝細胞凋亡與壞死[15]。NF-κB 參與對肝細胞凋亡反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并誘導肝細胞急性期反應(yīng)基因表達，引起肝臟炎癥[16]。高脂飲食的攝入使機體內(nèi)促炎因子水平升高，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后對機體內(nèi)促炎因子起到了一定的抑制作用，如表1所示。

由表1所示，Model組TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和 NF-κB 的含量與 Control 組相比顯著增加（P＜0.05），分 別 為 196.58 pg/mL、135.79 pg/mL、259.12 pg/mL、93.36 ng/mL、40.69 pg/mL、821.78 pg/mL。經(jīng)鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后，L.1301-17 組TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和NF-κB 的含量分別為 175.80 pg/mL、128.25 pg/mL、240.23 pg/mL、81.51 ng/mL、35.28 pg/mL、665.26 pg/mL，與 Model 組 相 比 均 顯 著 降 低（P＜0.05）；L.1301-72 組TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和NF-κB 的含量分別為 143.11 pg/mL、112.37 pg/mL、164.17 pg/mL、77.52 ng/mL、26.92 pg/mL、425.55 pg/mL，與 Model 組 相 比 均 顯 著 降 低（P＜0.05）；L.1301-72 組TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β和NF-κB 的含量相比于 L.1301-17 組顯著降低（P＜0.05），其 中 L.1301-72 組 和 Control 組 之 間 IL-6、TGF-β1、IL-1β和 NF-κB 的含量無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

表1 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳對大鼠血清促炎因子的影響（n=10，x±sd）

本研究探討了鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳對大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用。選取17 h和72 h兩種發(fā)酵時間制備鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預非酒精性脂肪肝病大鼠模型。研究表明，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳均可顯著降低FFA、ROS和促炎因子的水平，減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，改善了由高脂飲食誘導的肝損傷和非酒精性脂肪肝病。因此，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳對大鼠非酒精性脂肪肝具有改善作用，其中72 h 發(fā)酵乳更好地抑制血清中促炎因子、FFA 和ROS 的分泌，可能是長時間發(fā)酵產(chǎn)生了大量的代謝物質(zhì)，從而有利于與宿主產(chǎn)生共代謝關(guān)系，進一步促進代謝、抗氧化和免疫等功能。

有研究表明，肥胖、血脂異常、炎癥、和氧化應(yīng)激是引起NAFLD 的主要危險因素[17-20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，喂食4 周高脂飼料建模及益生菌干預4 周后，L.1301-17 組和 L.1301-72 組的大鼠體重較 Model 組顯著減少，表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳在不影響飲食攝入的情況下能夠減緩大鼠體重的增加。鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳均能顯著降低血清中 TC、TG 和 LDL-L 的含量以及升高 HDL-L 的含量，與 Chen 等[21]研究結(jié)果一致；AST 和 ALT 是評估機體肝臟功能和肝損傷最主要的兩個酶，研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預后顯著降低了ALT、AST 的含量，表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳可調(diào)節(jié)血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平。Al-Sheraji 等[22]發(fā) 現(xiàn) 假 絲 酵 母 G4 和長雙歧桿菌536 混合發(fā)酵的發(fā)酵乳干預 8 周后，HDL 水平升高，主要是由于乳酸菌產(chǎn)生大量的膽鹽水解酶（BSH），降低了血清膽固醇的水平。因此，在本研究中L.1301-17 組和L.1301-72 組中血脂指標水平降低的部分原因可能是鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 的BSH 活性。綜上，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳可緩解由高脂飲食帶來的血脂代謝紊亂，減輕肝損傷，對非酒精性脂肪肝病具有一定的保護作用。

肝臟病理情況顯示，與Model 組相比，經(jīng)益生菌發(fā)酵乳干預后的脂肪空泡數(shù)量顯著減少，表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳能夠減輕肝臟脂肪變性程度，對大鼠非酒精性脂肪肝具有改善效果。TNF-α、IL-6等炎癥因子，其含量可以反映炎癥嚴重程度，在肝細胞損傷發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。實驗結(jié)果顯示，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳均顯著抑制了促炎因子的分泌，其中72 h 發(fā)酵乳抗炎效果優(yōu)于17 h發(fā)酵乳，可能是長時間發(fā)酵產(chǎn)生更多的抗炎物質(zhì)，表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 長時發(fā)酵乳更好地調(diào)節(jié)炎癥因子的水平，對非酒精性脂肪肝病具有一定的改善作用。綜上以上結(jié)果，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳可以改善由高脂飲食誘導的肝損傷。Wang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌GG 顯著降低了TNF-a 的表達和緩解了肝炎，為本實驗結(jié)論提供支持。

ROS 的不斷積累使機體內(nèi)抗氧化劑逐漸耗竭，導致氧化應(yīng)激，從而引起脂肪變性，并與心血管疾病的發(fā)生存在一定的關(guān)系。Wang 等[24]研究表明，脂多糖可誘導肝癌細胞產(chǎn)生TNF-a，導致ROS 產(chǎn)生。FFA過氧化反應(yīng)影響線粒體的正常功能，從而導致ROS水平升高。SOD 作為機體內(nèi)主要的抗氧化酶，可清除ROS 含量，緩解肝損傷。在本研究中，通過鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳干預可降低由高脂飲食誘導的 TNF-α 和 FFA 水平，同時增加 SOD 的含量，與減少血清中ROS 的結(jié)果相一致，其中長時發(fā)酵乳具有更好的抗氧化作用。 因此，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳可調(diào)節(jié)FFA 和ROS 的水平，具有抗氧化作用，改善了肝細胞的損傷程度，對非酒精性脂肪肝病具有一定的改善作用。

4 結(jié) 論

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 發(fā)酵乳的攝入緩解了脂肪在肝臟上的堆積，控制了血脂水平，清除了游離脂肪酸和活性氧物質(zhì)的釋放，抑制了炎癥因子的激活，減輕了肝損傷，對大鼠非酒精性脂肪肝具有改善作用，為益生菌功能開發(fā)和產(chǎn)品應(yīng)用性能強化提供指導意義。其中，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 長時發(fā)酵乳具有更好地抗氧化、抗炎的益生特性，其具體作用機制需從分子水平深入探討。