生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)方法的優(yōu)化

楊小平，酈娟，何榮，曾慧君，楊永

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢430012）

0 引 言

β-內(nèi)酰胺酶為細(xì)菌代謝產(chǎn)生的一種蛋白，能裂解青霉素和頭孢類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使抗生素失活[1-2]。β-內(nèi)酰胺酶的分類有兩種方法：布氏法和Ambler的分子分類法[3-5]。近些年，部分不法生產(chǎn)者將其作為生鮮牛乳抗生素分解劑使用[6]，使牛乳達(dá)到乳品檢驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)[7]。生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶來源于兩個(gè)方面：外源性非法添加；內(nèi)源性誘導(dǎo)因素，牛體內(nèi)或牛乳中產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的微生物造成牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的殘留[8]。

目前關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法有頭孢硝基噻吩顯色法、酸度法、碘量法、高效液相色譜法、依賴基質(zhì)輔助激光解吸/電離傅立葉變換質(zhì)譜(MALDI-FTMS)法、酶聯(lián)免疫法和微生物杯碟法[9-11]。食品整治辦〔2009〕29 號文（后稱29 號文）中規(guī)定了乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法為杯蝶法。杯碟法的靈敏度高、結(jié)果判定簡單，基本可以滿足乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶檢測的需求，但在實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多方面的問題，如不同廠家的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，所用酶活性單位不一致，試驗(yàn)中青霉素G、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶最適使用濃度的選擇與搭配[12]；生鮮乳中內(nèi)源性殘留β-內(nèi)酰胺酶與產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株之間的關(guān)系等[13]，這些問題已經(jīng)有相關(guān)的報(bào)道。在日常杯蝶法檢驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)了其他的問題，如：抑菌圈形狀不規(guī)則，邊緣模糊，導(dǎo)致抑菌圈直徑偏差大，影響結(jié)果判斷；29 號文中規(guī)定的菌液濃度不易控制；牛津杯內(nèi)樣液易泄露造成試驗(yàn)失?。魂幮詫φ赵囼?yàn)不成立，試驗(yàn)失敗率高等問題。對此，我們在日常檢驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)積累中對29 號文的方法進(jìn)行了部分改進(jìn)與優(yōu)化，為我國制定更加合理、科學(xué)的β-內(nèi)酰胺酶檢測標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藤黃微球菌經(jīng)復(fù)蘇后活化三代左右，直接劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，可按工作需求接種多支斜面，作為工作菌株存放于4 ℃冰箱，一般可存放一個(gè)月；營養(yǎng)瓊脂，平板計(jì)數(shù)瓊脂，抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer；青霉素 G 鈉鹽，德國 Dr.Ehrenstorfer；β-內(nèi)酰胺酶，購自東京化學(xué)工業(yè)公司（TCI）。

恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；游標(biāo)卡尺，上海田島工具有限公司；滅菌鍋，松下電器（中國）有限公司；高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；牛津杯，新鄉(xiāng)市新華檢測儀器廠；0.45 μm 無菌過濾器，密理博。

1.2 試驗(yàn)方法與優(yōu)化

1.2.1 菌懸液的制備

試驗(yàn)前一天取4 ℃保存的藤黃微球菌斜面一支，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)16～24 h 后，將平板上的藤黃微球菌刮入5 mL 無菌EP 管內(nèi)，用2 mL無菌生理鹽水懸浮菌株制成菌懸液，用無菌生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，制成工作菌懸液。

1.2.2 樣品制備

檢驗(yàn)前先將生鮮乳樣品搖勻，取樣品20 mL 至離心管中，12 000 rpm/min 離心5 min，用注射器吸取離心后的生鮮乳，注意盡量不要吸到表層的脂肪質(zhì)以防堵塞無菌過濾器，連接無菌過濾器，將生鮮乳過濾到另一個(gè)無菌EP管內(nèi)待用。用無菌水做陰性對照。

1.2.3 檢驗(yàn)用平板的制備

取一次性無菌培養(yǎng)皿，先在底層鋪一薄層營養(yǎng)瓊脂，晃動(dòng)鋪勻，凝固備用；取上述制備好的菌懸液，加入不燙手的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，將含菌懸液的瓊脂培養(yǎng)基倒入上述平板中，晃動(dòng)鋪勻，凝固備用；取滅菌的牛津杯，在酒精燈上稍加熱后，將牛津杯放置在上述營養(yǎng)瓊脂表面，使牛津杯與瓊脂表面形成輕度粘連，每塊平板放置四個(gè)牛津杯，待用。

1.2.4 樣品測定

采用杯蝶法測定生鮮乳中殘留的β-內(nèi)酰胺酶，測定體系中關(guān)于青霉素、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶的濃度確定可按照參考文獻(xiàn)[12]的方法原理，通過抑菌圈的大小先確定青霉素的濃度與用量，再確定β-內(nèi)酰胺酶的濃度與用量，最后確定舒巴坦的濃度和用量。

1.2.5 結(jié)果報(bào)告

陰性對照：A，B，D 均產(chǎn)生抑菌圈且|A－B|≤3 mm 且|D－C|≥3 mm，重復(fù)性良好。陰性對照成立是試驗(yàn)成功的前提。

陽性：B，D 均產(chǎn)生抑菌圈且|C－D|≥3 mm 且|B－A|≥3 mm，重復(fù)性良好。

陰性：B，D 均產(chǎn)生抑菌圈且|C－D|≥3 mm 且|B－A|≤3 mm，重復(fù)性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液的濃度控制

在試驗(yàn)中，我們選擇了系列濃度梯度的藤黃微球菌菌懸液，加入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行測試，以陰性對照為例，各個(gè)不同菌量的試驗(yàn)條件下，抑菌圈直徑如表1 所示。從抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)分析，加入菌懸液的量對抑菌圈的直徑大小基本無影響，所以在實(shí)際檢驗(yàn)中不需要刻意控制，只需要保證藤黃微球菌生長狀態(tài)良好，無雜菌污染即可。

2.2 樣品前處理對抑菌圈的影響

在檢驗(yàn)中，我們比較了離心去脂肪層與無菌過濾處理和未做前處理的生鮮乳樣品，使用同樣的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，通過比較發(fā)現(xiàn)，離心與無菌過濾處理的生鮮乳樣品組，其抑菌圈呈圓形，邊緣清晰可見，比較規(guī)則，抑菌圈直徑易測量，測量數(shù)據(jù)基本無波動(dòng)（圖1）；而未經(jīng)過離心過濾處理的生鮮乳樣品，其抑菌圈不規(guī)則，有時(shí)類似橢圓形，有時(shí)呈蔓延式生長，有時(shí)抑菌圈邊緣不清晰，抑菌圈直徑不易測量。生鮮乳樣品如果不離心分離乳脂肪顆粒，基本無法過濾。以某養(yǎng)殖場某批次生鮮乳為樣品，將經(jīng)過離心與無菌過濾處理以及未處理的樣品分別進(jìn)行檢驗(yàn)，做三個(gè)平行，取A、B、C、D 管抑菌圈直徑的平均值，結(jié)果如表2所示。

表1 不同濃度的菌懸液測量的抑菌圈直徑

圖1 離心和無菌過濾的樣品檢驗(yàn)平板

表2 離心過濾處理與未處理的樣品測定結(jié)果

2.3 檢驗(yàn)用平板的制備技巧

按照29 號文的要求，檢驗(yàn)中需要用到抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ，在實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，完全可以用營養(yǎng)瓊脂代替抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ，制備檢驗(yàn)平板時(shí)，平板底層和含菌層只使用營養(yǎng)瓊脂，足以滿足藤黃微球菌生長繁殖中對營養(yǎng)的需求，以陰性對照為例，使用抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ和營養(yǎng)瓊脂的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。在制備檢驗(yàn)用平板時(shí)，需要將牛津杯放置在混合有藤黃微球菌的瓊脂面上，若直接放置牛津杯，在加樣品溶液、加蓋培養(yǎng)皿蓋、轉(zhuǎn)運(yùn)檢驗(yàn)平板時(shí)，極可能會(huì)導(dǎo)致牛津杯內(nèi)的樣品溶液直接泄露到檢驗(yàn)平板上，這將導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)的失敗。所以在制備檢驗(yàn)用平板時(shí)，第二層混合有藤黃微球菌的瓊脂層不必太厚，能夠覆蓋即可；同時(shí)在放置牛津杯時(shí)，可將牛津杯在酒精燈上稍加熱，讓牛津杯的余熱融化少量瓊脂，冷卻后，牛津杯將和瓊脂表面輕微粘連在一起，能有效防止牛津杯內(nèi)樣品溶液的泄露。

表3 使用抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ和營養(yǎng)瓊脂的抑菌圈直徑

2.4 青霉素、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶最佳使用濃度的確定

根據(jù)試驗(yàn)原理，青霉素抑制藤黃微球菌的生長，β-內(nèi)酰胺酶能降解青霉素，舒巴坦能抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性。所以我們先確定青霉素的濃度與用量，再確定β-內(nèi)酰胺酶的濃度和用量，最后確定舒巴坦的濃度與用量。整個(gè)試驗(yàn)體系的關(guān)鍵是青霉素、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶三者之間的濃度與使用量的配比。關(guān)于青霉素的濃度與用量，參照29 號文使用量5 μL，我們配制了不同濃度的青霉素工作液，抑菌圈直徑如表4所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，按照29號文的濃度與用量，0.1 mg/mL的青霉素溶液，產(chǎn)生的抑菌圈直徑能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

表4 不同青霉素濃度的抑菌圈直徑

β-內(nèi)酰胺酶的濃度與用量是本試驗(yàn)的關(guān)鍵。在確定好青霉素的濃度與使用量之后，根據(jù)29 號文中的判定規(guī)則，純水陰性對照的結(jié)果為A、B、D 均應(yīng)產(chǎn)生抑菌圈，C 不產(chǎn)生抑菌圈，據(jù)此來確定β-內(nèi)酰胺酶的濃度與用量。29 號文中規(guī)定β-內(nèi)酰胺酶的濃度為16 000 U/mL，使用量為25 μL。目前市面上常見的β-內(nèi)酰胺酶主要有TCI 和Sigma 公司生產(chǎn)，其酶活性單位并不統(tǒng)一。嚴(yán)格來講，需要依照中華人民共和國藥典（2015 版）第四部生物活性測定法中青霉素酶及其活力測定法進(jìn)行測定酶活，但實(shí)際檢驗(yàn)中如此操作會(huì)比較麻煩。我們可以參照β-內(nèi)酰胺酶的標(biāo)簽說明配制β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)工作液，β-內(nèi)酰胺酶的濃度與使用量以C 剛好不產(chǎn)生抑菌圈為宜，即C 管內(nèi)的β-內(nèi)酰胺酶剛好可以全部失活A(yù) 管內(nèi)的青霉素。因每個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用的β-內(nèi)酰胺酶品牌不統(tǒng)一，β-內(nèi)酰胺酶的活性單位也不統(tǒng)一，所以本文不提供β-內(nèi)酰胺酶的具體濃度與使用量。

舒巴坦的濃度和用量則依據(jù)D 的抑菌圈直徑來確定。實(shí)際檢驗(yàn)中如果完全依照29 號文中的試劑濃度與用量進(jìn)行檢驗(yàn)，以陰性對照為例，發(fā)現(xiàn)D 沒有產(chǎn)生抑菌圈，或者D 產(chǎn)生的抑菌圈與C 相比小于3 mm，這說明β-內(nèi)酰胺酶過量，需要降低β-內(nèi)酰胺酶的用量，或者增加舒巴坦的用量，確保在陰性對照中D 產(chǎn)生的抑菌圈與C 相比大于3 mm。根據(jù)實(shí)際檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，D 的抑菌圈直徑在16 mm 左右為宜。

3 討論與總結(jié)

在試驗(yàn)中我們首先探討了藤黃微球菌的菌懸液濃度與抑菌圈直徑之間的關(guān)系。通過大量的試驗(yàn)證實(shí)，在日常檢驗(yàn)中無需刻意調(diào)整菌懸液的濃度，菌懸液的濃度與用量不影響抑菌圈的直徑大小，只是最終檢驗(yàn)平板的顏色有深淺的區(qū)別。因?yàn)樘冱S微球菌對青霉素高度敏感，所以試驗(yàn)菌株的菌量對抑菌圈的直徑無影響。生鮮乳中各類微生物較多，含量各異[14]，在檢驗(yàn)中如果對生鮮乳樣品不過濾除菌，理論上這些微生物將或多或少與青霉素發(fā)生相互作用，導(dǎo)致與藤黃微球菌發(fā)生作用的青霉素的量有變化，最終將影響抑菌圈的直徑，所以理論上樣品必須是無菌的。生鮮乳樣品離心去除脂肪顆粒，這些脂肪顆粒將直接影響過濾的效果與速率，如果不去除這些脂肪顆粒，這些脂肪顆粒還可能會(huì)與樣品溶液中的青霉素、舒巴坦或β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生相互作用，最終影響抑菌圈的直徑；同時(shí)，脂肪顆粒等大顆粒雜質(zhì)可能會(huì)限制青霉素、舒巴坦和β-內(nèi)酰胺酶在瓊脂層的擴(kuò)散，最終影響抑菌圈的形狀或直徑，所以生鮮乳樣品必須離心過濾除菌。在檢驗(yàn)用平板制備環(huán)節(jié)，我們優(yōu)化了培養(yǎng)基的使用，因?yàn)樘冱S微球菌的營養(yǎng)要求不高，營養(yǎng)瓊脂足以滿足其生長中的營養(yǎng)需求。通過微加熱巧妙的種植牛津杯，能有效防止牛津杯中的樣品溶液直接泄露到瓊脂平板上，提高試驗(yàn)的成功率。最后，通過陰性對照組中抑菌圈的直徑來調(diào)整試驗(yàn)體系中青霉素、舒巴坦和β-內(nèi)酰胺酶這三種試劑之間的濃度與使用量，確保整個(gè)試驗(yàn)體系的有效性。通過以上各種措施的聯(lián)合使用，將大大提高試驗(yàn)的成功率，試驗(yàn)結(jié)果的判定分析也更清晰，為制定食品中β-內(nèi)酰胺酶檢測標(biāo)準(zhǔn)提供參考。