PMA/EMA-LAMP法應用于VBNC狀態(tài)活菌檢測的研究進展

馮雪,王冠蕾,侯俊材

（1.東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室, 哈爾濱150030；2. 承德石油高等?？茖W校, 河北承德067000）

0 引 言

作為全球關注的食品安全問題，食源性致病菌在過去幾十年對公眾健康造成了重大威脅。而且世界衛(wèi)生組織的調查表明，食源性致病菌的毒力感染呈上升趨勢[1]?；畹牟豢膳囵B(yǎng)（viable but non-culture, VBNC）狀態(tài)是細菌對抗惡劣環(huán)境的獨特生存策略。VBNC 狀態(tài)的細菌不能在異養(yǎng)板上生長，但仍具有代謝活性、致病性和毒性。VBNC 狀態(tài)的細菌在適宜的條件下能夠恢復和恢復培養(yǎng)和致病性。VBNC 狀態(tài)下食源性病原體的出現(xiàn)促進了食源性感染的發(fā)生[2]，且使檢測變得更加困難。因此，本文概述了VBNC 的特點和基于LAMP 的方法檢測VBNC，以期為檢測VBNC 的方法更新提供理論參考。

1 VBNC 細菌概述

1982 年，徐懷恕等人[3]對霍亂弧菌和大腸桿菌進行觀察研究時，首次發(fā)現(xiàn)并且提出關于細菌的“有活力但不可培養(yǎng)（Viable but non-culturable, VBNC）”狀態(tài)。細菌在處在不適宜的環(huán)境條件下，其細胞就會在形態(tài)和生理上發(fā)生變化，不再進行分裂，導致在常規(guī)培養(yǎng)基上不能形成菌落，但是細胞仍然保持完整的結構和代謝活性。許多專家認為VBNC 狀態(tài)是某些不產生芽胞的革蘭氏陽性(G+)細菌和多種革蘭氏陰性(G-)細菌的抗逆反應，這種狀態(tài)能夠幫助細菌度過逆境；也有一些專家認為VBNC 狀態(tài)只是細菌生命循環(huán)的一個過程。

乳及乳制品含有豐富營養(yǎng)物質，能夠滿足人體對多種營養(yǎng)元素的需要，因此它也是大部分食源性致病菌的天然培養(yǎng)基[4]。部分乳制品在巴氏殺菌過程中能夠殺死絕大部分食源性致病菌，同時乳制品的酸性條件也可以有效地抑制致病菌的生長和增殖[5]。但是，目前越來越多的研究成果表明，乳及乳制品中的致病菌能夠被誘導，然后進入VBNC，它們保留毒力，在適當?shù)臈l件下會復蘇，仍具有活力。2002 年，Gunasekera等人[6]的研究結果表明，經(jīng)過巴氏殺菌的鮮乳中明顯含有細胞亞群進入VNBC，熱處理過程中大量的細胞不能夠形成菌落，但仍然可以轉錄翻譯，具有可以測量的代謝活性，并具有致病性。1996 年，Gahan 等人[7]對單增李斯特菌在酸奶、普通奶酪、低脂奶酪以及全脂奶酪中的耐酸性研究發(fā)現(xiàn)，70 d 后，低脂奶酪和全脂奶酪中的單增李斯特菌突變體ATM56 恢復活性，研究結果表明單增李斯特菌在乳及乳制品中存在VBNC 狀態(tài)，但是其誘導和復蘇因素需要進一步研究。VBNC 狀態(tài)下的細胞復蘇能力、代謝活性、平板培養(yǎng)能力和細胞完整性區(qū)別其它幾種常見的細胞狀態(tài)，具體區(qū)別如表1所示[1]。

表1 不同狀態(tài)細胞的不同生物學特性的比較

迄今為止，已有85 種以上的細菌被誘導進入VBNC 狀態(tài)，包括大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、創(chuàng)傷弧菌和乳酸桿菌[8]。Diane 和Nystrom[9]的研究表明VBNC 狀態(tài)是非芽孢細菌對抗不利環(huán)境（暴露于極端溫度、紫外線光休克、重金屬、低pH、缺乏營養(yǎng)和氧化應激）的適應性策略。細胞在VBNC 狀態(tài)下維持代謝活性。進入VBNC 狀態(tài)后，細胞在保持其代謝活性的同時不受損傷，其誘導機制與孢子形成相似。目前，食源性細菌通常由實驗室采用標準培養(yǎng)方法進行監(jiān)測和鑒定，包括預富集和選擇性富集，然后進行一系列形態(tài)學和生化鑒定，通常4～7 d才能獲得鑒定結果[10]。VBNC 狀態(tài)下的細菌不能在常規(guī)平板培養(yǎng)基上定植，傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測方法復雜、耗時長，已不適用于VBNC 狀態(tài)下的細胞檢測，在食品質量和食源性致病菌的監(jiān)測中，迫切需要有效的方法[11]。

2 VBNC 細菌形成機制

近年來，人們對VBNC 狀態(tài)的形成機理逐漸了解。2011 年，Moorhead 等[12]人發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)對群體感應（Quorum sensing，QS)信號分子 C4-HSL、OH-C4-HSL、HSL 和 C12-HSL等有反應，具體表現(xiàn)為延緩進入VBNC 狀態(tài)以及阻礙生物膜的形成，此菌株自身同樣分泌一種新的化合物，其結構功能與QS 信號分子相似，所以QS、VBNC狀態(tài)及生物膜的形成的調節(jié)機制可能相似。2014 年，這一推測被Ayrapetyan 等[13]人進一步證實，他們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)在VBNC 狀態(tài)下可直接被其QS信號分子AI-2 喚醒，并證明不產生AI-2 的突變菌株不能從VBNC 狀態(tài)復蘇，添加外源AI-2 后可以復蘇，但是此復蘇過程不僅與信號分子AI-2 相關，可能還與σ 因子Rpo S 相關，缺失Rpo S 的突變株不能復蘇，并且加入外源AI-2 后仍然不能復蘇。這一結果與2013年Kusumoto等[14]人的研究相一致，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌(S.enterica）的LT2 VBNC 突變體具有較高的Rpo S 表達能力，具體表現(xiàn)為延緩進入VBNC 狀態(tài)，從而推測Rpo S對VBNC 狀態(tài)具有調控作用。

另一方面，無機聚磷酸鹽的代謝對細胞的功能具有重要的調節(jié)作用[15]。有學者發(fā)現(xiàn)，調節(jié)無機磷酸鹽代謝的聚磷酸鹽激酶能夠促使細菌進入VBNC 狀態(tài)[16-17]。并且有明確的證據(jù)指出，無機磷酸鹽及其同源酶同時存在于許多細菌體內，說明了在細菌體內，無機磷酸鹽的代謝可能普遍存在。而這些細菌中的大部分都具有進入VBNC 狀態(tài)的能力[18]，這就大大增加了無機磷酸鹽代謝參與VBNC 狀態(tài)調節(jié)的可能性。但是目前為止，有關無機磷酸鹽對細菌進入VBNC 狀態(tài)調節(jié)用的機理，觸發(fā)和復蘇等問題仍不清楚，需進一步研究。

3 LAMP法概述

2000 年，Notomi等人[19]首次報道了一種新的檢測方法—環(huán)介導等溫核酸擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。LAMP 采用了具有長鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶和4-6 條引物，以高特異性識別目標序列的6 個不同區(qū)域，并具有獨特的擴增機制，其產物在瓊脂糖凝膠電泳上能夠呈現(xiàn)出典型的階梯狀條帶；同時，反應體系中的Mg2+與從dNTPs中析出的P2O74-結合，生成副產物白色Mg2P2O7沉淀；另外，因為擴增產物的大量生成，加入熒光染料后，紫外燈下能夠觀察到明顯熒光。所以，LAMP 擴增不但觀察結果方式多樣，且結果鑒定操作簡便，對于高通量的快速檢測極為適合。因為LAMP技術具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點[20]，已經(jīng)逐漸被應用于中沙門氏菌、阪崎腸桿菌、分支桿菌屬、金黃色葡萄球菌等病原微生物的檢測[21-24]。然而，LAMP法仍然存在一些缺點，例如，PCR或LAMP本身無法區(qū)分存活的死細胞和VBNC細胞的存在，導致對目標微生物的高估。為了克服這個缺點，PCR 和LAMP 結合活性染料直接檢測活的食源性病原體[25]。近年來，人們利用DNA 插層劑來阻止死亡細菌的DNA 擴增，乙錠單疊氮化合物（ethidium monoazide bromide，EMA）或 疊氮 溴 化 丙 錠（propidium monoazide，PMA）染料能穿透膜損傷細胞并與DNA分子結合，從而抑制死細胞的DNA 擴增，同時允許活細胞的未結合DNA 擴增，因此，將這些染料與PCR 或LAMP結合，來區(qū)分VBNC細胞與死細胞[26-27]。

4 LAMP的原理

LAMP 技術主要應用的原理為鏈的置換[28]，如圖1所示，恒溫條件下通過Bst 2.0 DNA 聚合酶催化反應的進行。LAMP 擴增反應分為兩步進行，即啞鈴狀模板形成的起始步驟和反應擴增的循環(huán)步驟。反應過程包含內外部兩種引物，內部引物由FIP（Forward Inner Priner）和 BIP（Backgroud Inner Priner）組成，其中FIP 包括 F1c 和 F2，BIP 包括 B1c 和 B2，外部引物由 F3和B3組成。

啞鈴狀模板形成的起始步驟中，經(jīng)過LAMP 循環(huán)后，每條鏈的末端會形成發(fā)夾狀的DNA 即為起始結構。FIP上的F2與其互補序列F2c結合形成雙鏈，通過Bst2.0 DNA 聚合酶的催化作用，DNA 擴增自 F2 的 5’末端開始，形成一條新的DNA單鏈與其模板鏈結合后形成新的DNA 雙鏈。以外部引物F3為起始的新鏈與其模板鏈結合形成雙鏈，原合成的DNA單鏈被置換下來，在5’末端的F1和F1c兩個區(qū)域內進行堿基配對，從而產生發(fā)夾結構。BIP上的B2與互補序列B2c相結合從而形成新鏈，然后與其模板互補配對形成新的DNA雙鏈，與此同時，5’端的環(huán)狀結構打開，外部引物上的B3與B3c雜交，并以其為起點開始合成新鏈，以BIP起始的單鏈解離下來形成新的單鏈，其兩個末端分別為FIP 和BIP。由于兩個末端發(fā)生堿基互補配對，所以兩個發(fā)夾結構，這就是LAMP的基礎結構。

在反應的擴增循環(huán)步驟中，發(fā)夾結構中的F1 末端作為起點，模板是其自身，進行DNA 的擴增延伸。同時，F(xiàn)IP 中的F2 與F2c 雜交，新一輪的置換反應開始。F1 末端的合成單鏈脫離模板解離為單鏈。而解離后的單鏈核酸存在互補結構從而導致環(huán)狀結構的形成。環(huán)狀結構上形成的B2c，與BIP 的引物雜交，開始新一輪擴增反應。LAMP 的反應產物為類似花狀的環(huán)結構和雙鏈發(fā)夾結構。

圖1 LAMP技術反應原理

5 PMA/EMA-LAMP 在 VBNC 狀態(tài)細菌檢測中的應用

PMA 和EMA 作為一種 DNA 分子核酸染料，只能滲透死亡細菌的細胞壁或細胞膜，并與其中的DNA 共價結合，阻礙其擴增反應的發(fā)生。PMA/EMA-LAMP 利用優(yōu)化的引物，探索了VBNC 狀態(tài)下3 種食源性致病菌不同組分的水平和比例[29]。PMA/EMA-LAMP的詳細設計如下。

首先，用一定濃度的PMA 或EMA 原液處理0.1 mL 達到107CFU 的細胞懸液，然后立即移入暗室（室溫下）靜置5 min，然后將其置于碎冰中，在15 cm的距離處暴露于鹵素燈（500 W）15 min。根據(jù)常用的基因組DNA 提取試劑盒的指示，對VBNC 和死亡細胞進行總DNA 提取，然后進行前面描述的LAMP 反應。最后，通過變色、濁度、瓊脂糖凝膠分析和實時熒光分析，驗證了該方法的可行性。

5.1 大腸桿菌

大腸桿菌(Escherichia coli)作為環(huán)境中最常見的革蘭氏陰性菌之一，引起人類嚴重的胃腸道疾病，如出血性腹瀉、出血性結腸炎和溶血性尿毒癥綜合征，兒童和老年人死亡率高達50%以上[30]。此外，大腸桿菌中VBNC 態(tài)的誘導條件（紫外線或低溫）也給消除過程帶來了障礙。VBNC 狀態(tài)下的細胞在培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)陰性結果，影響實驗結果。

2014 年，Wang 等人[31]用 PMA 或 EMA 進行 VBNC狀態(tài)細胞與死亡細胞的分化。以大腸桿菌中特定的 rfbE 基因為靶點，采用PMA-qPCR 法對VBNC 狀態(tài)下的細胞進行定量分析。該方法的定量限為102mL-1，但PMA-PCR 檢測時間長、檢測限低、成本高等缺點給其進一步應用帶來了很大的障礙。有研究學者采用了rBE 基因，以及主要毒素基因（STX1 和STX2）基因，并分別從快速檢測VBNC 狀態(tài)中開發(fā)出三個PMA-LAMP 檢測。研究表明，PMA 濃度為40 mg/mL 時，LAMP 檢測完全被抑制，且比色LAMP 檢出限為 10 pg/mL，比 PCR（10 ng/mL）更敏感，特異性和陽性預測值均為100%。

5.2 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)作為一種廣泛分布于沿海和河口環(huán)境中的嗜鹽菌，在所有流行的食物中毒暴發(fā)中，特別是在生的或未煮熟的海鮮中，有50%～70%被分離為致病因子[32]。副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性桿菌，在低溫下易被誘導進入VBNC 狀態(tài)。目前，副溶血性弧菌的常規(guī)檢測方法需要7 d 的時間。因此，迫切需要快速、準確的檢測方法[33]。

大量研究表明[34-35]，耐熱直接溶血素（tdh）基因作為副溶血性弧菌的特異性標記物，可以使用PMA-PCR 篩查VBNC 狀態(tài)。然而，很少有研究報道EMA 或PMA 聯(lián)合LAMP 檢測副溶血性弧菌。2012年，Wang[36]開發(fā)了一種EMA-LAMP分析法，用于區(qū)分副溶血性弧菌的VBNC狀態(tài)細胞和死亡細胞。值得注意的是，EMA 對VBNC 狀態(tài)下的副溶血性弧菌DNA擴增沒有抑制作用，這與PMA不同。LAMP法和PCR法對模板的敏感性分別為9 fg/管和900 pg/管，說明LAMP 法比 PCR 法更敏感。此外，Zhong[37]等人在2016年開發(fā)了一種基于PMA的實時熒光燈分析法，用于檢測VBNC狀態(tài)下的副溶血性弧菌，該方法利用了副溶血性弧菌中的熱標記溶血素(tlh)基因。26株中有10株為不同血清型的副溶血性弧菌，非副溶血性弧菌有16株。結果表明，PMA-RF-LAMP在4mg/mL的PMA作用下，再暴露5 min，可用于區(qū)分活細胞和死細胞。另一方面，在不受食物基質、死細胞和其他細菌干擾的情況下，對26株參考菌株的特異性為100%。

5.3 葡萄球菌

金黃色葡萄球菌(S.aureus）是一組革蘭氏陽性、兼性需氧菌，通常是未被包裹的有機體，可導致多種組織感染和多種疾病[38]（包括皮膚感染、肺炎、心內膜炎和骨髓炎）。葡萄球菌腸毒素可引起的葡萄球菌食物中毒，是一種重要的食源性致病菌，是世界上最重要的食源性疾病之一，占食物中毒暴發(fā)病例的95%，是世界范圍內公共衛(wèi)生的主要問題。傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基檢測方法通常需要6 d，可能存在假陰性[39]。同時，在VBNC 狀態(tài)下，用上述培養(yǎng)基方法檢測不到金黃色葡萄球菌。在金黃色葡萄球菌的監(jiān)測中，建立一種快速、靈敏、經(jīng)濟、操作簡便的檢測方法，對處于VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌進行鑒定，并采取相應的預防措施[40]。

目前，已有學者證明可以將LAMP 應用于以nuc基因為靶點的金黃色葡萄球菌分離株的鑒定。然而，nuc 基因作為檢測金黃色葡萄球菌的合適靶點的適用性可能需要進一步深入的研究，因為它的敏感性低于PCR。2012 年，Xu[41]等人。首次對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌和非葡萄球菌進行了3 種LAMP 鑒別試驗的開發(fā)和應用。此外，PMA-LAMP 法在VBNC 狀態(tài)下檢測金黃色葡萄球菌方面也取得了顯著進展。該方法具有快速、簡單（對于過程和結果測定）、成本效益低（等溫設備、水浴或熱塊）、靈敏度高、廣泛性和應用靈活性高的顯著優(yōu)點。在不含環(huán)引物的情況下，該方法在65 ℃下檢測時間為65 min，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測和PCR 檢測相比，縮短了檢測時間。

5.4 單增李斯特菌

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種重要的食源性致病菌，也是乳制品、蔬菜和畜禽產品等食品的主要污染菌[42]，世界衛(wèi)生組織已將其列為四大食源性致病菌之一[43]，所以，研究者密切關注單增李斯特菌的污染問題。傳統(tǒng)的檢測方法需要分離、篩選以及生化鑒定等步驟，費時費力，因此，建立快速準確的檢測方法具有十分重要的意義。

由于LAMP 技術特異性高、靈敏性強、簡便快速的特點，被廣泛地應用于檢測致病菌的研究中[44]，但是LAMP 技術是以DNA 為檢測對象，所以此方法不能區(qū)分活/死細胞，易出現(xiàn)結果呈假陽性的現(xiàn)象。2011年，蔣亞男等人[45]建立了PMA-LAMP 的分析方法快速檢測單增李斯特活菌，同時，比較分析了PMA-PCR 方法的靈敏度。2012 年，呂淑霞等人[46]采用EMA-LAMP 方法，同樣可以快速的檢測單增李斯特菌。利用PMA/EMA-LAMP 技術，不僅能夠有效識別單增李斯特菌的活/死細胞，而且具有較高的靈敏度。同時，PMA/EMA 與LAMP 相結合的技術與PCR 技術、實時熒光 PCR 技術等[47-48]相比，避免使用類似PCR 等昂貴的設備，減少了DNA 熱變性、溫度循環(huán)等步驟，所以其檢測成本更低、反應更迅速、操作更簡便。

6 展 望

食源性致病菌的VBNC 狀態(tài)是各種食源性致病菌存在的獨特機制，給公眾健康帶來了嚴重威脅。采用可靠的檢測方法對VBNC 細胞進行簡單、靈敏的鑒定是非常重要的。由于VBNC 細胞的活性和不可培養(yǎng)性，給傳統(tǒng)的CFU 檢測帶來了障礙，基于LAMP 的檢測方法已逐漸成為鑒定VBNC 狀態(tài)細胞的可靠工具。雖然表現(xiàn)相同，但PMA 比EMA 更有效地抑制活、死信號。綜上所述，PMA/EMA-LAMP 或其他基于LAMP 的方法在人們面臨多種傳染病威脅的地區(qū)研究局部流行病具有很大的潛力。此外，建立了PMA-RF-LAMP 法定量分析細菌的VBNC 狀態(tài)，拓寬了其應用范圍。然而，在擴增反應中還存在一些缺陷和缺陷，如污染和假陽性現(xiàn)象。在今后的工作中，各種技術（PMA/EMA-LAMP 和表面等離子體共振生物傳感器）的合作可以開發(fā)出簡單有效的遺傳檢測裝置，能更有效的檢測VBNC 細胞。