離子交換色譜法測(cè)定調(diào)制乳粉和固體飲料中低聚木糖

宋戈，劉長(zhǎng)玲，張勝楠

（黑龍江省華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，哈爾濱150028）

0 引 言

低聚木糖是一類由2-9 個(gè)D-木糖分子分子以β-1, 4 木糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖[1]。低聚木糖作為一種可溶性膳食纖維[2],具有很好的生理特性,可以調(diào)節(jié)腸道菌群,預(yù)防癌癥,降低血壓、血脂和血糖等生理學(xué)功效,是一種提高免疫力、促進(jìn)身體健康的理想益生元[3]。除被應(yīng)用于調(diào)理腸胃、緩解便秘的保健食品中外，低聚木糖作為一種效價(jià)比較高的雙歧因子，現(xiàn)已成功地應(yīng)用到調(diào)制乳粉、固體飲料等行業(yè)中，能高效準(zhǔn)確地測(cè)定其中低聚木糖含量十分必要。目前常見(jiàn)的測(cè)定方法有通過(guò)直接測(cè)定木二糖至木七糖組分含量[1,4-6]的方法，但木四糖、木五糖木六糖標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，木七糖和木八糖等高聚合度低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)樣品難以獲取, 而且測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)的樣品時(shí)，木二糖和木三糖會(huì)受到雜質(zhì)干擾無(wú)法準(zhǔn)確定量。也有經(jīng)酸水解為木糖來(lái)間接測(cè)定[7-13]的方法和再進(jìn)行衍生反應(yīng)后測(cè)定的方法[14]，但只適用于含量較高基質(zhì)簡(jiǎn)單的保健食品，前處理不適用基質(zhì)復(fù)雜的調(diào)制奶粉和固體飲料中低聚木糖的提取與測(cè)定。

本研究嘗試復(fù)雜基質(zhì)的調(diào)制乳粉和固體飲料樣品中低聚木糖提取和水解的條件，采用優(yōu)化的離子色譜分析條件直接測(cè)定樣品水解前后木糖的含量，二者之差經(jīng)換算后獲得低聚木糖的含量，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，干擾小，可為復(fù)雜基質(zhì)的調(diào)制乳粉和固體飲料中低聚木糖含量的測(cè)定提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與設(shè)備

ICS-5000 離子色譜儀配備脈沖安培檢測(cè)器,thermo 公司；TTL-DCⅡ水浴加熱儀,北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；pB-10 酸度計(jì)，德國(guó)Sartorius 公司；KQ-250DE 超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX3 渦旋混合器，德國(guó) IKA 公司；SQP 天平，德國(guó)Sartorius公司。

1.2 材料與試劑

木糖(≥99%),德國(guó) Dr.Ehretorfer 公司；50%氫氧化鈉(色譜純)、乙酸鈉(色譜純),SIGMA 公司；濃硫酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）,西隴公司；WatersOasis HLB 固相萃取柱 3cc/60mg,美國(guó) Waters 公司；所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm 的超純水；以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液與淋洗液的配制

木糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(500 mg/L):準(zhǔn)確稱取0.05 g(精確至0.1 mg)的木糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50 mL 燒杯中,加入約10 mL 熱水,溶解后冷卻至室溫,用水稀釋至25 mL 容量瓶中,搖勻。

木糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:取適量木糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用水配制成質(zhì)量濃度為 1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、1 000.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

淋洗液A 純水：電阻率≥18.2 MΩ·cm 的超純水。

淋洗液B 氫氧化鈉溶液(200 mmol/L)：取10.4 mL 50%氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1 000 mL，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，緩慢搖勻。

淋洗液C乙酸鈉(500 mmol/L)混合溶液：稱取41 g無(wú)水乙酸鈉(精確至0.01 g)，用約500 mL 水溶解，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，脫氣10 min，加入7.8 mL50%氫氧化鈉溶液，并用水稀釋至1 000 mL，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，緩慢搖勻。

1.3.2 樣品處理

稱取調(diào)制乳粉或固體飲料約2.5 g 于50 mL 三角瓶中，加入20 mL (50±5 ℃）的水將試樣振蕩溶解并超聲20 min，再用1.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值到4.5，用水定容至50 mL 過(guò)濾，此為水解前供試品溶液，濾液依次通過(guò)0.22 μm 水相濾膜和活化過(guò)的HLB凈化柱，棄去前面2 mL，收集后面溶液上機(jī)測(cè)定水解前木糖含量。準(zhǔn)確移取5.0 mL 樣品濾液于帶螺紋蓋的水解玻璃管中，加1.0 mL 4.0 mol/L 硫酸溶液混勻后于沸水浴水解100 min，取出，冷卻，用水轉(zhuǎn)移到三角瓶中，再用1.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值到4.5，用水定容至50 mL 過(guò)濾，濾液依次通過(guò)0.22 μm水相濾膜和活化過(guò)的HLB 凈化柱，棄去前面2 mL，收集后面溶液上機(jī)測(cè)定水解后木糖含量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：CarboPac PA10，250×4.6 mm；保護(hù)柱：CarboPac PA10，50×4 mm ；檢測(cè)器參數(shù)：Au 電極，Ag-Cl參比模式，標(biāo)準(zhǔn)四電位波形；流速：1.0mL/min。

淋洗條件：0～20 min，20 mmol/LNaOH；20.1～30 min，100mmol/L NaOH 500 mmol/L NaAc ；30.1～40 min，200 mmol/L NaOH ；40.1～50 min，20 mmol/L NaOH 。進(jìn)樣方式:自動(dòng)進(jìn)樣；進(jìn)樣體積:25 μL；柱溫:30 ℃。木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜見(jiàn)圖1。

1.3.4 木糖與低聚木糖的換算

圖1 木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

在水解過(guò)程中，低聚木糖的β-1, 4-糖苷鍵會(huì)斷裂并與水分子結(jié)合生成糖苷羥基，使得生成的木糖質(zhì)量比水解前的低聚木糖質(zhì)量高。水解后木糖與水解前的低聚木糖質(zhì)量之比用平均轉(zhuǎn)化系數(shù)表示，其數(shù)值因低聚木糖的聚合度而異，均值約為1.06（以木二糖計(jì)）[1]。因此，測(cè)定樣品中水解前后木糖含量的差值除以1.06即為樣品中低聚木糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解條件的優(yōu)化

低聚木糖由2～9 個(gè)木糖單元，以β-1, 4-糖苷鍵連接而成的低聚糖混合物[1]，易溶于水。文獻(xiàn)報(bào)道[7-14]均選取4 mol/L 硫酸在100 ℃的溫度條件下水解條件,以盡可能地完全水解低聚木糖。調(diào)制乳粉和固體飲料不同于文獻(xiàn)報(bào)道中的低聚木糖保健品和原料，成分較為復(fù)雜，為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)含70.0 mg/L 低聚木糖的調(diào)制乳粉樣品溶液進(jìn)行不同水解條件的測(cè)定?？疾炝嗽?00 ℃的溫度條件下, 加入1 mL 4 mol/L 硫酸溶液，反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響見(jiàn)圖2。

另外考察了在100 ℃的溫度條件下, 反應(yīng)時(shí)間為100 min，加入4 mol/L 硫酸溶液，加入的硫酸溶液體積對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響見(jiàn)圖3。最終確定為1.3.2 中的水解條件。

圖2 樣品水解時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

圖3 樣品水解酸度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 色譜條件的確定

NaOH 溶液中所含有的OH-離子可以促進(jìn)糖中羥基的酸性解離, 從而增強(qiáng)它們?cè)陉庪x子交換色譜柱上的保留。各種糖在堿性條件下存在電離度的差異，可以通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫液的組成及濃度實(shí)現(xiàn)分離。NaOH 作為常規(guī)洗脫液之一，在糖的分析中扮演著雙重角色，既為糖的電離提供堿性環(huán)境，同時(shí)也是洗脫劑，因此改變NaOH 的濃度對(duì)于糖的保留時(shí)間有較大的影響。調(diào)制乳粉和固體飲料水解后會(huì)有大量的半乳糖、葡萄糖和其他單糖生成產(chǎn)生，當(dāng)淋洗液中NaOH 溶液的濃度過(guò)大，測(cè)定低聚木糖水解生成的木糖就會(huì)受干擾。采用20 mmol/L NaOH 為淋洗液等度洗脫時(shí), 樣品中低聚木糖水解生成的木糖與樣品中乳糖水解產(chǎn)生的半乳糖、葡萄糖和其他單糖能完全分離，但是對(duì)于強(qiáng)保留的雜質(zhì)洗脫不下來(lái)。沒(méi)能洗脫下來(lái)的雜質(zhì)會(huì)對(duì)下一個(gè)樣品的測(cè)定產(chǎn)生影響，導(dǎo)致保留時(shí)間的不穩(wěn)定和測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性差，必須采用具有更強(qiáng)淋洗能力的醋酸鈉溶液進(jìn)行洗脫[15-16]。NaAc 相對(duì)于NaOH 具有更強(qiáng)的洗脫力，采用1.3.3 的色譜條件，樣品中低聚木糖測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較好。樣品水解前與水解后測(cè)定色譜見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 調(diào)制乳粉水解前(a)與水解后(b)測(cè)定色譜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取不同濃度1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L、1 000.0 mg/L 的木糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入離子色譜儀，記錄目標(biāo)峰峰面積。以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制線性回歸曲線，其線性關(guān)系為:y=13.717x-1.311，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993,線性范圍1.0～1 000 mg/L，并以3 倍信噪比計(jì)算出固體樣品稱取2.5克的檢出限為200 mg/kg。

圖5 固體飲料水解前(a)與水解后(b)測(cè)定色譜

2.4 回收率和精密度

以同一個(gè)不含低聚木糖的配方乳粉為實(shí)驗(yàn)材料，稱取2.5 g樣品后，再分別加入1.0 mg和5.0 mg的低聚木糖添加劑原料（純度大于95%），每個(gè)濃度的添加樣品進(jìn)行8 次平行測(cè)定，計(jì)算回收率與回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)?；厥章试?7.2%～102.9%，回收率的RSD 在3.89%～8.36%。同時(shí)對(duì)含低聚木糖的配方乳粉和固體飲料2 個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品進(jìn)行8 次平行測(cè)定，樣品測(cè)定值的RSD 在2.39%～6.56%。由此可以看出，測(cè)定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好，準(zhǔn)確性較好。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照本方法對(duì)市售的配方乳粉和固體飲料樣品進(jìn)行低聚木糖含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。從實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，該方法的靈敏度和準(zhǔn)確度可以滿足實(shí)際測(cè)試的需求。

表1 樣品中低聚木糖的含量

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)探討了復(fù)雜基質(zhì)的調(diào)制乳粉和固體飲料樣品中低聚木糖水解的條件，將低聚木糖各組分完全水解為木糖，再結(jié)合優(yōu)化的離子色譜分析條件直接測(cè)定樣品水解前后木糖的含量，二者之差經(jīng)換算后獲得低聚木糖的含量。該方法具有良好的線性，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，干擾小，同時(shí)重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，適合復(fù)雜基質(zhì)的調(diào)制乳粉和固體飲料中低聚木糖含量的生產(chǎn)監(jiān)測(cè)和日常監(jiān)管檢測(cè)。