HPLC法同時(shí)測(cè)定珠芽景天藥材中8種黃酮苷類成分的含量

吳瑩瑩 雷艷 姚成芬 馬雪 黃勇 李勇軍 林昌虎

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）12-1436-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.06

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定珠芽景天藥材中8種黃酮苷類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定珠芽景天藥材中山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（1→2）-α-L-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（KGGR）、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（KGR）、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-α-L-鼠李糖苷（QRR）、BulbiferumosideⅡ、山柰酚-3-O-（6-香豆?；?β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷（KcGGR）、山柰酚-3-O-（2-β-D-葡萄糖）-α-L-鼠李糖-7-O-α-L-鼠李糖苷（KGRR）、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷（KRR）、山柰酚-3-O-（6″-乙?；?β-D-葡萄糖）-7-O-α-L-鼠李糖苷（KaGR）的含量。色譜柱為Waters CORTECS C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果：上述8種成分均達(dá)到基線分離，檢測(cè)進(jìn)樣量的線性范圍分別為0.013～0.052、0.005～0.018、0.008～0.031、0.010～0.042、0.009～0.038、0.008～0.030、0.009～0.037、0.032～0.130 μg（r均不低于0.999 0）;檢測(cè)限分別為0.08、0.14、0.11、0.21、0.42、0.35、0.23、0.28 μg/mL，定量限分別為0.25、0.47、0.38、0.69、1.40、1.17、0.77、0.93 μg/mL;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD均小于3%（n為6或7）;平均加樣回收率為99.67%～104.20%（RSD為0.17%～1.59%，n=6）。13批樣品中，上述8種成分的平均含量分別為0.893 8、0.312 6、0.490 8、0.964 9、0.751 2、0.502 2、0.606 2、1.915 7 mg/g（n=3）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定珠芽景天藥材中8種黃酮苷類成分的含量。

關(guān)鍵詞 珠芽景天;高效液相色譜法;黃酮苷類成分;含量測(cè)定

Simultaneous Determination of 8 Flavonoid Glycosides in Sedum bulbiferum by HPLC

WU Yingying1，2，LEI Yan1，2，YAO Chengfen1，2，MA Xue1，HUANG Yong3，LI Yongjun1，LIN Changhu1（1. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM/State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 2. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 3. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 8 flavonoid glycosides in Sedum bulbiferum. METHODS： HPLC method was adopted to determine the contents of kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside-（1→2）-α-L-glucopy- ranoside-7-O-α-L-glucopyranoside （KGGR）， kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside （KGR）， quercetin-3- O-α-L-rhamnose-7-O-α-L-rhamnoside （QRR）， BulbiferumosideⅡ， kaempferol-3-O-（6-coumarinyl）-β-D-glucose-（1→2）-β-D-glu- cose-7-O-α-L-rhamnoside （KcGGR）， kaempferol-3-O-（2-β-D-glucose）-α-L-rhamnose-7-O-α-L-rhamnoside （KGRR）， kaempferol-3- O-α-L-rhamnoside-7-O-α-L-rhamnoside （KRR）， kaempferol-3-O-（6″-acetyl-β-D-glucose）-7-O-α-L-rhamnoside （KaGR） in S. bulbi- ferum. The determination was performed on Waters CORTECS C18 column with mobile consisted of acetonitrile -0.1% phosphoric acid water solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 5 μL. RESULTS： The linear range of 8 constituents were 0.013-0.052， 0.005-0.018， 0.008-0.031， 0.010-0.042， 0.009-0.038， 0.008-0.030， 0.009-0.037， 0.032-0.130 μg， respectively （all r were not less than 0.999 0）. The limits of detection were 0.08， 0.14， 0.11， 0.21， 0.42， 0.35， 0.23， 0.28 μg/mL，respectively. The limits of quantification were 0.25， 0.47， 0.38， 0.69， 1.40， 1.17， 0.77， 0.93 μg/mL， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （24 h） were all lower than 3% （n=6 or n=7）. The average recoveries were 99.67%-104.20% （RSDs=0.17%-1.59%， n=6）. Average contents of above 8 constituents in 13 batches of samples were 0.893 8， 0.312 6， 0.490 8， 0.964 9， 0.751 2， 0.502 2， 0.606 2， 1.915 7 mg/g（n=3）. CONCLUSIONS： The method is simple， acourate and reproducible， and can be used for simultaneous determination of 8 flavonoid glycosides in ? ? ? ?S. bulbiferum.

KEYWORDS Sedum bulbiferum; HPLC; Flavonoid glyco- sides; Content determination

珠芽景天為景天科植物珠芽景天（Sedum bulbiferum Makino.）的干燥全草，又名小箭草、珠芽半支，廣泛分布于我國(guó)南部地區(qū)，野生資源豐富，是我國(guó)民間常用的植物藥，可用于治療寒熱瘧疾、食積腹痛、熱毒癰腫等癥[1-3]?；瘜W(xué)成分研究顯示，珠芽景天主要含有生物堿類、多糖類、三萜類、黃酮類、礦質(zhì)元素等化學(xué)成分[4-9]。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物為珠芽景天的主要成分，并分離得到以山柰酚、槲皮素為母核的苷類化合物，包括山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（1→2）-α-L-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（KGGR）、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（KGR）、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-α-L-鼠李糖苷（QRR）、BulbiferumosideⅡ、山柰酚-3-O-（6-香豆?；?β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷（KcGGR）、山柰酚-3-O-（2-β-D-葡萄糖）-α-L-鼠李糖-7-O-α-L-鼠李糖苷（KGRR）、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷（KRR）、山柰酚-3-O-（6″-乙?；?β-D-葡萄糖）-7-O-α-L-鼠李糖苷（KaGR）等。已有藥理活性研究表明，珠芽景天的黃酮類成分對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2、人食管癌細(xì)胞株EC109、人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的體外增殖有抑制作用[10-11]。

中藥成分復(fù)雜多樣且質(zhì)量不易控制，這在一定程度上制約了中藥的研究與開發(fā)。目前，有關(guān)珠芽景天質(zhì)量控制的研究報(bào)道較少，僅見黃酮苷元槲皮素和山柰素的定量研究[10-11]，然而僅通過單一化學(xué)成分的含量測(cè)定難以全面評(píng)估珠芽景天的質(zhì)量。近年來，多指標(biāo)含量測(cè)定已廣泛應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制，如白花蛇舌草、大黃、三葉青等[12-14]。因此，本研究擬建立同時(shí)測(cè)定珠芽景天藥材中上述8種主要黃酮苷類成分含量的高效液相色譜法（HPLC），旨在為該藥材的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型HPLC儀，包括系統(tǒng)控制器、輸液泵、脫氣組件、低壓梯度組件、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、溫控樣品室、二極管陣列檢測(cè)器、Chromeleon 7.0色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Allegra 64R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）;WP-UP-Ⅳ-20型超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）;EL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

珠芽景天藥材采自貴州省各地，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為景天科景天屬植物珠芽景天（S. bulbiferum Makino.）的干燥全草，13批藥材樣品來源見表1。KGGR、KGR、QRR、BulbiferumosideⅡ、KcGGR、KGRR、KRR、KaGR對(duì)照品均為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC面積歸一法檢測(cè)純度均大于98.0%;乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.1%磷酸水溶液（B）;梯度洗脫（0～5 min，5%A→12%A;5～15 min，12%A→13%A;15～30 min，13%A;30～45 min，13%A→14%A;45～60 min，14%A→15%A）;流速：0.8 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取KGGR、KGR、QRR、Bulbiferumoside Ⅱ、KcGGR、KGRR、KRR和KaGR對(duì)照品適量，精密稱定，分別用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得單一對(duì)照品貯備液。精密吸取上述單一對(duì)照品貯備液各適量，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含KGGR 13.0 μg、KGR 4.6 μg、QRR 7.7 μg、Bulbiferumoside Ⅱ 10.4 μg、KcGGR 9.4 μg、KGRR 7.5 μg、KRR 9.3 μg、KaGR 32.4 μg的混合對(duì)照品溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取珠芽景天藥材適量，粉碎后，過40目篩。精密稱取上述粉末1 g，加入50%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量后，水浴加熱回流1 h，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取空白對(duì)照溶液（甲醇溶液）和“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S5）、混合對(duì)照品溶液適量，空白對(duì)照溶液和供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，混合對(duì)照溶液用甲醇稀釋5倍后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，在該色譜條件下，KGGR、KGR、QRR、Bulbiferumoside Ⅱ、KcGGR、KGRR、KRR和KaGR的分離度均良好，且色譜峰峰形對(duì)稱，理論板數(shù)按QRR峰計(jì)均不低于17 000。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，制成KGGR、KGR、QRR、Bulbiferumoside Ⅱ、KcGGR、KGRR、KRR和KaGR質(zhì)量濃度分別為2.60、0.92、1.54、2.08、1.88、1.50、1.86、6.48 μg/mL的混合溶液，分別精密吸取5、8、10、12、15、18、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.3.3 檢測(cè)限與定量限考察 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，以甲醇倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別確定其定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，KGGR、KGR、QRR、Bulbiferumoside Ⅱ、KcGGR、KGRR、KRR和KaGR的檢測(cè)限分別為0.08、0.14、0.11、0.21、0.42、0.35、0.23、0.28 μg/mL，定量限分別為0.25、0.47、0.38、0.69、1.40、1.17、0.77、0.93 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取同一批珠芽景天（編號(hào)：S5）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，KGGR、KGR、QRR、Bulbiferumoside Ⅱ、KcGGR、KGRR、KRR和KaGR峰面積的RSD分別為0.48%、0.96%、0.86%、0.86%、0.39%、0.77%、0.82%、0.83%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批珠芽景天藥材（編號(hào)：S5）粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各待測(cè)成分的含量。結(jié)果，KGGR、KGR、QRR、Bulbiferumoside Ⅱ、KcGGR、KGRR、KRR和KaGR含量的RSD分別為1.00%、0.47%、2.15%、1.66%、2.53%、2.72%、2.71%、1.17%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批珠芽景天藥材（編號(hào)：S5）粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，KGGR、KGR、QRR、Bulbiferumoside Ⅱ、KcGGR、KGRR、KRR和KaGR峰面積的RSD分別為1.39%、1.29%、1.99%、1.90%、1.80%、1.97%、1.10%、0.84%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的珠芽景天藥材（編號(hào)：S5）粉末，共6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別按各成分在藥材中的含量等量加入相應(yīng)單一對(duì)照品貯備液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測(cè)定

稱取13批珠芽景天藥材粉末各1 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算8種黃酮苷類成分的含量。每批平行操作3次，結(jié)果見表4。

由表4結(jié)果可見，所測(cè)13批珠芽景天藥材中8種黃酮苷類成分含量差異不大，其中平均含量最高的是KaGR（1.915 7 mg/g），平均含量最低的是KGR（0.312 6 mg/g）。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇

本課題組前期分別考察了提取方法（超聲、回流）、提取溶劑[水、不同體積分?jǐn)?shù)（100%、75%、50%、25%）的甲醇和乙醇]、提取時(shí)間（0.5、1、2、4 h）對(duì)珠芽景天提取率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以50%乙醇回流1 h的提取率較高，且提取時(shí)間適宜，故最終選擇此方法作為供試品溶液的制備方法。

3.2 色譜條件選擇

本課題組前期分別對(duì)色譜柱（ACE Excel 5 C18-AR、ACE Excel 5 C18、Waters CORTECS C18）、流動(dòng)相（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)色譜柱為Waters CORTECS C18、流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫）時(shí)，珠芽景天中8種黃酮苷類成分的色譜峰峰形、分離度均較好，且基線平穩(wěn)，故最終選用此色譜條件。本課題組在全波長(zhǎng)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，珠芽景天中這8種黃酮苷類成分均在254 nm波長(zhǎng)處有較理想的色譜響應(yīng)，且與其他雜質(zhì)峰分離度也較好，故選擇254 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究所建方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度、精密度高，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可用于同時(shí)測(cè)定珠芽景天藥材中8種黃酮苷類成分的含量，可為其質(zhì)量控制及進(jìn)一步開發(fā)利用提供方法支持。

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（收稿日期：2020-01-17 修回日期：2020-04-06）

（編輯：鄒麗娟）