積雪草總苷對老年消化不良模型大鼠胃腸動力及腸神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用量效關(guān)系及機制研究

田徐露 藍程 岑運光 王太昊 崔曉燕

中圖分類號 R965;R975 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）12-1429-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.05

摘 要 目的：探究積雪草總苷對老年消化不良（FD）模型大鼠胃腸動力及腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）保護作用的量效關(guān)系及機制。方法：將16月齡老年雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組和積雪草總苷低、中、高劑量組（15、30、60 mg/kg），每組8只。采用夾尾刺激聯(lián)合不規(guī)則飲食法持續(xù)4周以建立老年大鼠FD模型。造模完成后隔日，給藥組大鼠灌胃相應(yīng)劑量積雪草總苷藥液，對照組和模型組大鼠灌胃等容生理鹽水，每日1次，連續(xù)15 d。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測大鼠血清中胃動素（MTL）、血管活性腸肽（VIP）的含量;測定大鼠胃排空率和小腸推進比;采用免疫熒光法和免疫組織化學(xué)法檢測大鼠胃竇組織中ENS標(biāo)志物[中樞神經(jīng)特異性蛋白（S100β）和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）]的表達情況;采用Western blotting法檢測胃竇組織中S100β、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（GFAP）、蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5）、GDNF、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK）以及磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白的表達水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組和積雪草總苷低、中劑量組大鼠胃排空率和小腸推進比以及血清中MTL含量和胃竇組織中PGP9.5蛋白表達水平顯著降低，血清中VIP含量和胃竇組織中S100β、GFAP、GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，積雪草總苷各劑量組大鼠胃排空率和小腸推進比均顯著升高（P<0.05）;除積雪草總苷低劑量組GFAP蛋白表達水平變化不顯著（P>0.05）外，各劑量組大鼠血清中MTL含量和胃竇組織中PGP9.5蛋白表達水平均顯著升高，血清中VIP含量和胃竇組織中S100β、GFAP、GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。上述胃腸動力指標(biāo)含量和相關(guān)因子蛋白表達水平有部分或大多數(shù)在積雪草總苷不同劑量組之間有顯著差異（P<0.05），且高劑量組各指標(biāo)可恢復(fù)至與空白對照組無顯著差異的水平（P>0.05）。結(jié)論：積雪草總苷能劑量依賴性地改善老年FD模型大鼠的胃腸動力不足、ENS功能異常，且以高劑量組（60 mg/kg）的作用效果最明顯;其機制可能與促進內(nèi)源性MTL釋放并抑制VIP分泌、抑制GDNF及下游信號通路激活并促進ENS和腸神經(jīng)元修復(fù)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 積雪草總苷;消化不良;胃腸動力;腸神經(jīng)系統(tǒng);膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;機制;量效關(guān)系;老年大鼠

Study on Dose-effect Relationship and Mechanism of Protective Effects of Total Asiaticoside on Gastrointestinal Motility and Enteric Nervous System in Aged Functional Dyspepsia Model Rats

TIAN Xulu1，LAN Cheng2，CEN Yunguang1，WANG Taihao1，CUI Xiaoyan1（1. Health Care Center， Hainan Provincial Peoples Hospital， Haikou 570311， China; 2. Dept. of Gastroenterology， Hainan Provincial Peoples Hospital， Haikou 570311， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To explore the dose-effect relationship and mechanism of protective effects of total asiaticoside （TA） on gastrointestinal motility and enteric nervous system（ENS） in aged functional dyspepsia（FD） model rats. METHODS： Aged male SD rats of 16 months old were randomly divided into blank control group，model group，TA low dose， medium dose and high dose groups （15， 30， 60 mg/kg）， with 8 rats in each group. FD model was established by tail-stimulation combined with irregular diet for 4 weeks. The next day after modeling， administration groups were given relevant doses of TA solution intragastrically; control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 15 d. Gastric emptying rate and small intestinal propulsion rate of rats were examined. ELISA were used to detect serum contents of MTL and VIP. Immunofluorescence and immunohistochemistry were proposed to measure the expression of ENS marker （S100β and GDNF） in gastric antrum tissue. The protein expression of S100β， GFAP， PGP9.5， GDNF， p-MEK and p-ERK1/2 in gastric antrum tissue were measured by Western blotting assay. RESULTS： Compared with blank control group， gastric emptying rate and small intestinal propulsion rate， serum MTL content and protein expression of PGP9.5 in gastric antrum tissue of model and TA low，medium dose group were decreased significantly， while serum VIP content， protein expressions of S100β， GFAP， GDNF， p-MEK and p-ERK1/2 in gastric tissue were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， gastric emptying rate and small intestinal propulsion rate of TA groups were increased significantly （P<0.05）; except for GFAP protein in TA low dose group （P>0.05）， the serum MTL content and the expression of PGP9.5 protein in gastric antrum tissue of rats in TA groups were increased significantly， while serum VIP content， protein expression of S100β， GFAP， GDNF， p-MEK and p-ERK1/2 in gastric antrum tissue were decreased significantly （P<0.05）. Some or most of the content of gastrointestinal motility indexes and related factor protein expression were significantly different among TA groups （P<0.05）， and the indexes in TA high dose group could recover to the levels which were not significantly different with blank control group （P>0.05）. CONCLUSIONS： TA can dose-dependently improve the gastrointestinal motility deficiency and ENS dysfunction in aged FD model rats， especially in high dose （60 mg/kg）of TA group. Its mechanism may be related with promoting the release of endogenous MTL， inhibiting the secretion of VIP， expression of GDNF and the activation of downstream signaling pathway， and promoting the repair of ENS and intestinal neurons.

KEYWORDS ? Total asiaticoside; Functional dyspepsia; Gastrointestinal motility; Enteric nervous system; GDNF; Mechanism; Dose-effect relationship; Aged rat

功能性消化不良（Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是一組源自上腹部，持續(xù)或反復(fù)存在腹痛、腹脹、燒灼感或早飽感的癥候群[1]。流行病學(xué)資料顯示，我國FD發(fā)病率高達18%～35%[2]，其中60歲以上的老年人由于胃腸動力障礙、胃酸分泌紊亂等生理功能退化，成為了FD的高危人群[3]。臨床上除了使用抗酸藥和促動力藥治療FD外，中醫(yī)藥及針灸等補充治療方法也逐漸受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。積雪草總苷是包含積雪草苷、羥基積雪草苷、積雪草苷B等在內(nèi)的三萜類皂苷成分混合提取物，近年來大量研究表明，積雪草總苷在治療胃潰瘍和胃癌等胃腸道疾病方面具有一定作用[4-6]，但其對老年FD的治療作用尚未見研究報道。以往的研究表明，胃腸活動的調(diào)控和支配同時受到腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）、胃腸起搏細胞和平滑肌等在內(nèi)的神經(jīng)沖動傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的控制，其中ENS作為由腸神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞（EGCs）構(gòu)成的獨立單位，可不依賴CNS發(fā)揮對胃腸道活動的獨立調(diào)控作用[7]。另有研究證實，膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）的異常表達也與FD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8]?；诖?，本研究采用積雪草總苷干預(yù)老年FD模型大鼠，并通過檢測大鼠體內(nèi)ENS特異性標(biāo)志物中樞神經(jīng)特異性蛋白S100β、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（GFAP）、蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5），以探究積雪草總甘對ENS的保護作用;同時，通過考察GDNF及相關(guān)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）/絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）信號通路相關(guān)因子的變化，探究積雪草總苷對老年FD模型大鼠保護作用的量效關(guān)系和可能機制，為臨床治療老年FD療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BT25S型電子天平（德國Sartorius公司）;Multiskan MK3型酶標(biāo)儀、Sorvall ST 8型臺式離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Cryo3DM型冷凍切片機（日本Sakura公司）;AiryScan LSM800型激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）;IX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Tanon-1200型凝膠成像系統(tǒng)、EPS600型電泳儀（上海天能科技有限公司）;UPH-I-5/10/20T型臺式標(biāo)準(zhǔn)型超純水機（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

積雪草總苷原料藥（廣西昌洲天然藥業(yè)有限公司，批號：84696219，含量：95%）;胃動素（MTL）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（批號：20180318）、血管活性腸肽（VIP）ELISA檢測試劑盒（批號：20180430）均購自南京建成生物工程研究所;GFAP兔單克隆抗體、S100β兔單克隆抗體、PGP9.5兔單克隆抗體、GDNF兔單克隆抗體、磷酸化MEK（p-MEK）兔單克隆抗體、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）兔單克隆抗體（批號分別為GB11096、GB14146、GB11159、GB11403、GB12304、GB11507）以及花菁染料3（Cy3）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號分別為GB21303、GB23204）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）小鼠單克隆抗體（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，批號：100242-MM05）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010S）、RIPA裂解液（批號：P0013B）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號：P0018AS）以及DAPI染色液、牛血清白蛋白（BSA）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒及蛋白上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，以色列BI公司，批號：020241ACS;工作pH為7.45）;枸櫞酸緩沖液即用型干粉（廣州賽國生物科技有限公司，批號：BL604A;工作pH為6.0）;12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）預(yù)制膠（上海瑞楚生物科技有限公司，批號：R07027）;氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號：20190628，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g;作生理鹽水用）;二甲苯、無水乙醇等其余試劑均為分析純或由實驗室自行配制，水為超純水。

1.3 動物

SPF級老年SD大鼠40只，雄性，16月齡，體質(zhì)量為（300.0±20.0）g，購自南通大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）20190001。大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為（23.0±2.0）℃恒溫、（60.0±5.0）%恒濕、自然光晝夜交替。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗，實驗操作嚴(yán)格遵守動物實驗倫理要求的相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取老年大鼠40只，隨機分為空白對照組、模型組以及積雪草總苷低、中、高劑量組，每組8只。除空白對照組大鼠正常飲食外，其余組大鼠均采用不規(guī)則飲食聯(lián)合夾尾刺激的復(fù)合造模法[9]復(fù)制FD模型，造模時間持續(xù)4周。造模結(jié)束后觀察大鼠一般情況，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，以大鼠毛色發(fā)黃、便溏、活動靈敏度下降、體質(zhì)量減輕、進食飲水量減少，且解剖觀察（在實驗結(jié)束后）示其胃腸組織無器質(zhì)性損傷為造模成功。造模完成后隔日，給藥組大鼠分別灌胃低、中、高劑量的積雪草總苷藥液（15、30、60 mg/kg，以生理鹽水配制;劑量設(shè)置參照文獻方法[10]），灌胃體積為200 μL;空白對照組和模型組大鼠灌胃等容生理鹽水。各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)15 d。給藥期間，大鼠均自由飲水進食;觀察大鼠一般情況及胃腸道器質(zhì)性損傷的發(fā)生情況。

2.2 大鼠血清中MTL、VIP的含量檢測

各組大鼠末次給藥12 h后（期間禁食不禁水），在其眼眶采血，收集血樣至EP管中，在37 ℃水浴中孵育30 min后，以2 000 r/min離心5 min，分離上層血清。參照ELISA試劑盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀檢測血清中MTL、VIP的含量。

2.3 大鼠胃腸動力檢測

各組大鼠眼眶采血后繼續(xù)禁食不禁水12 h（以確保大鼠未處于應(yīng)激狀態(tài)），然后灌胃5%炭末阿拉伯膠混懸液（參照文獻方法[11]配制）50 mg/kg，記錄灌胃質(zhì)量（M1）。灌胃30 min后處死大鼠，開腹結(jié)扎賁門和幽門，測定幽門至盲腸（不含盲腸）的總長度（a），記錄各組大鼠幽門至炭末類固體糊前端的推進距離（b），按公式計算小腸推進比：小腸推進比=b/a×100%。剖取完整胃組織，吸除多余血水后稱定總質(zhì)量（M2），再沿胃大彎剖開胃后去除殘余胃容物并稱定凈質(zhì)量（M3），按公式計算胃排空率：胃排空率=[1-（M2-M3）/M1]×100%。取部分胃竇組織在-20 ℃下凍存，其余部分進行后續(xù)切片制備及相關(guān)檢測。

2.4 大鼠胃竇組織中S100β表達情況檢測

采用免疫熒光法檢測。取“2.3”項下各組大鼠胃竇組織適量，行常規(guī)石蠟包埋后切片（厚度約5 μm），再經(jīng)二甲苯、無水乙醇脫蠟水化后，加入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，在98 ℃ 下高溫處理20 min修復(fù)抗原;以PBS漂洗切片3次去除修復(fù)液，在5%BSA溶液中室溫封閉30 min;加入S100β抗體（稀釋度為1 ∶ 500），在4 ℃下孵育過夜;以PBS漂洗切片3次去除一抗孵育液，加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫下避光孵育30 min;以PBS漂洗切片3次去除二抗孵育液，加入DAPI染色液，于室溫核染5 min后封片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠胃竇組織中S100β的表達情況（鏡下S100β陽性表達呈紅色熒光，胃竇組織細胞核經(jīng)DAPI染色后呈藍色熒光）。

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠胃竇組織中GDNF表達情況檢測

采用免疫組織化學(xué)法檢測。取“2.3”項下各組大鼠胃竇組織適量，按“2.4”項下方法制備大鼠胃竇組織切片并進行抗原修復(fù);以PBS漂洗切片3次去除修復(fù)液，在5%BSA溶液中室溫封閉30 min;加入GDNF抗體（稀釋度為1 ∶ 500），在4 ℃下孵育過夜;以PBS漂洗3次去除一抗孵育液，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫下孵育1 h;以PBS漂洗切片3次去除二抗孵育液，吸除多余水分，向切片中滴加DAB顯色液，室溫下反應(yīng)5 min后，以PBS沖洗終止反應(yīng)。上述切片經(jīng)乙醇梯度脫水后采用二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干，采用倒置顯微鏡觀察大鼠胃竇組織中GDNF的表達情況（鏡下GDNF陽性表達呈棕黃色）。

2.6 大鼠胃竇組織中S100β、GFAP、PGP9.5、GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達水平檢測

采用Western blotting（WB）法檢測。取“2.3”項下冷凍保存的各組大鼠胃竇組織50～80 mg，充分剪碎，加入RIPA裂解液0.5 mL并置于冰上迅速研磨，提取組織總蛋白。收集組織總蛋白勻漿液，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法進行蛋白定量;加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸變性。取50 μg等量蛋白，在120 V恒壓下行12%SDS-PAGE，電泳時間100 min。電泳結(jié)束后，以200 mA恒流轉(zhuǎn)移蛋白條帶至活化后的PVDF膜上;依次加入S100β、GFAP、PGP9.5、GDNF、p-MEK、p-ERK1/2和GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），在4 ℃下孵育過夜;以PBST緩沖液清洗3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫下孵育2 h;以PBST緩沖液清洗3次，再滴加ECL發(fā)光液進行反應(yīng)后，采用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光并采集圖像。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J 1.6.0軟件分析各目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度值之比，用來表示目標(biāo)蛋白的表達水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用x±s表示，多組間數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分析和方差齊性檢驗后采用單因素方差分析（ANOVA）進行比較，兩組間數(shù)據(jù)采用LSD-t檢驗進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況及胃腸道損傷狀況

與空白對照組比較，造模大鼠持續(xù)便溏，飲食飲水量較少，且精神萎靡、活動減少;實驗完畢解剖后均未見胃腸道器質(zhì)性損傷，表明老年FD大鼠模型復(fù)制成功。

3.2 積雪草總苷對老年FD模型大鼠血清中MTL、VIP含量的影響

與空白對照組比較，模型組和積雪草總苷低、中劑量組大鼠血清中MTL含量顯著降低，VIP含量顯著升高（P<0.05）;而積雪草總苷高劑量組大鼠血清中上述指標(biāo)含量與空白對照組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，積雪草總苷低、中、高劑量組大鼠血清中MTL含量均顯著升高，且高劑量組該指標(biāo)含量顯著高于低、中劑量組;VIP含量均顯著降低，且高劑量組該指標(biāo)含量顯著低于低、中劑量組（P<0.05）。各組大鼠血清中MTL和VIP含量比較見表1。

3.3 積雪草總苷對老年FD模型大鼠小腸推進比和胃排空率的影響

與空白對照組比較，模型組和積雪草總苷低、中劑量組大鼠的小腸推進比和胃排空率均顯著降低（P<0.05）;而積雪草總苷高劑量組大鼠上述指標(biāo)與空白對照組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，積雪草總苷低、中、高劑量組大鼠小腸推進比和胃排空率均顯著升高，且高劑量組胃排空率顯著高于低劑量組（P<0.05）;而積雪草總苷各劑量組間其余指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠小腸推進比和胃排空率比較見表2。

3.4 積雪草總苷對大鼠胃竇組織中ENS特異性標(biāo)志物S100β、GFAP、PGP9.5表達的影響

3.4.1 S100β的免疫熒光法檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠胃竇組織中S100β陽性表達明顯增加且多分布于胃竇黏膜組織、少量分布于肌層;與模型組比較，積雪草總苷低、中、高劑量組大鼠胃竇組織中S100β陽性表達均明顯減少，其中積雪草總苷高劑量組大鼠胃竇組織中S100β陽性表達分布最少，僅見于胃竇內(nèi)肌層。各組大鼠胃竇組織中S100β陽性表達的免疫熒光法檢測顯微圖見圖1（其中，Cy3標(biāo)記熒光圖用于表示S100β陽性表達;DAPI染色熒光圖用于表示胃竇組織的細胞定位;Merge圖是前兩者疊加圖像，用于定位S100β在細胞中的表達位置）。

3.4.2 S100β、GFAP、PGP9.5蛋白表達的WB法檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組和積雪草總苷低、中劑量組大鼠胃竇組織中S100β、GFAP蛋白表達水平均顯著升高，PGP9.5表達水平顯著降低（P<0.05）;而積雪草總苷高劑量組上述指標(biāo)水平與空白對照組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，除低劑量組GFAP蛋白變化不顯著（P>0.05）外，積雪草總苷低、中、高劑量組大鼠胃竇組織中S100β、GFAP蛋白表達水平均顯著降低，且高劑量組上述指標(biāo)水平顯著低于低、中劑量組，中劑量組上述指標(biāo)水平顯著低于低劑量組;PGP9.5蛋白表達水平均顯著升高，且高劑量組該指標(biāo)水平顯著高于低、中劑量組，中劑量組該指標(biāo)水平顯著高于低劑量組（P<0.05）。各組大鼠胃竇組織中S100β、GFAP、PGP9.5蛋白表達的電泳圖見圖2，蛋白表達水平比較見表3。

3.5 積雪草總苷對大鼠胃竇組織中GDNF及相關(guān)ERK/MEK信號通路相關(guān)因子表達的影響

3.5.1 GDNF表達的免疫組化法檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠胃竇組織中GDNF陽性表達明顯增加，且在黏膜層分布較為集中。與模型組比較，積雪草總苷低、中、高劑量組大鼠胃竇組織中GDNF陽性表達均明顯減少，且積雪草總苷高劑量組大鼠胃竇組織中GDNF陽性表達在各劑量組中最少，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴趨勢。各組大鼠胃竇組織中GDNF表達的免疫組化法檢測顯微圖見圖3。

3.5.2 GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達的WB法檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組和積雪草總苷低、中劑量組大鼠胃竇組織中GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;而積雪草總苷高劑量組大鼠胃竇組織中上述指標(biāo)水平與空白對照組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，積雪草總苷低、中、高劑量組上述3種蛋白的表達水平均顯著降低，且高劑量組上述指標(biāo)水平顯著低于低、中劑量組，中劑量組GDNF、p-ERK1/2水平顯著低于低劑量組（P<0.05）。各組大鼠胃竇組織中GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達的電泳圖見圖4，蛋白表達水平比較見表4。

4 討論

老年FD患者的病理機制復(fù)雜，常受到多方面因素影響，而目前其常規(guī)臨床治療方案的效果也都較為有限。為尋找安全有效的治療方法，本課題組在前期研究中篩選了多種活性物質(zhì)，考察其對FD模型動物的改善作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量（60 mg/kg）的積雪草總苷具有胃腸動力改善及ENS保護作用，且作用效果與陽性藥多潘立酮相似。但關(guān)于積雪草總苷的作用機制尚未明確，故本研究對積雪草總苷作用于老年FD模型大鼠保護作用的量效關(guān)系及具體機制進行了探索。

一方面，胃腸動力障礙是FD發(fā)生的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[12]。本研究結(jié)果顯示，積雪草總苷能顯著提高老年FD模型大鼠胃腸動力指標(biāo)即小腸推進比和胃排空率，表明積雪草總苷能夠促進緩解胃動力障礙。根據(jù)文獻報道，MTL和VIP是胃排空、胃腸運動的重要調(diào)節(jié)因子[13-14]。本研究通過檢測大鼠血清中MTL、VIP的含量后發(fā)現(xiàn)，不同劑量積雪草總苷均能顯著提高MTL的含量并降低VIP的含量，尤其積雪草總苷高劑量組大鼠血清中MTL、VIP的含量較模型組顯著改善，并恢復(fù)至與空白對照組無顯著差異的水平。上述結(jié)果表明，積雪草總苷促進老年FD模型大鼠的胃排空、胃腸動力恢復(fù)的機制可能與其促進內(nèi)源性MTL釋放并抑制VIP分泌有關(guān)。

另一方面，除ENS外絕大多數(shù)胃腸活動的神經(jīng)傳導(dǎo)都受到CNS的調(diào)控[15]，因此近年來ENS的獨立作用機制研究受到越來越多的國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，而FD的發(fā)生和發(fā)展也被證實與ENS功能的變化密切相關(guān)[16]。研究表明，小鼠腸動力的減弱與GFAP和S100β mRNA表達水平的升高有關(guān);大鼠腸道運動功能障礙可能與PGP9.5蛋白水平的降低相關(guān)，而腸動力恢復(fù)的機制可能與PGP9.5蛋白表達水平的提高有關(guān)[17-19]。本研究結(jié)果顯示，積雪草總苷能劑量依賴性地抑制老年FD模型大鼠胃竇組織中S100β和GFAP的表達，并促進PGP9.5的表達，提示積雪草總苷可能通過促進受損神經(jīng)元的恢復(fù)、抑制EGCs的積聚來發(fā)揮改善胃腸道活動的作用。

GDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，已有研究表明，在FD模型大鼠體內(nèi)，GDNF能夠促進p-MEK、p-ERK1/2蛋白的異常升高[20]。研究表明，MEK、ERKl/2蛋白表達及磷酸化程度與大鼠胃腸組織細胞及功能的完整性密切相關(guān)，神經(jīng)損傷及體內(nèi)多種炎癥因子能夠誘導(dǎo)p-MEK、p-ERK1/2的過度表達，進而抑制胃腸蠕動功能[21-22]。本研究結(jié)果顯示，積雪草總苷能劑量依賴性地降低大鼠胃竇組織中GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白的表達水平，而MEK、ERK1/2蛋白的磷酸化水平的降低也提示積雪草總苷能夠通過抑制GDNF表達、抑制ERK/MEK信號通路的激活，進而促進老年FD模型大鼠ENS的修復(fù)和神經(jīng)元功能的恢復(fù)，最終發(fā)揮對其胃腸功能的調(diào)節(jié)作用。

此外，本研究比較了不同劑量積雪草總苷對老年FD模型大鼠的作用效果后發(fā)現(xiàn)，中劑量（30 mg/kg）的積雪草總苷對大鼠胃排空率、小腸推進比以及血清中MTL、VIP含量影響較低劑量組（15 mg/kg）無顯著差異;而積雪草總苷高劑量組（60 mg/kg）大鼠胃排空率與低劑量組比較，血清中MTL、VIP含量與低、中劑量組比較，其改善效果均更顯著。在組織水平蛋白表達檢測中，積雪草總苷中劑量組大鼠胃竇組織中S100β、GFAP、GDNF、p-ERK1/2蛋白表達水平較低劑量組均顯著降低，PGP9.5蛋白表達水平較低劑量組顯著升高;積雪草總苷高劑量組大鼠胃竇組織中S100β、GFAP、GDNF、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達水平較低、中劑量組均顯著降低，PGP9.5蛋白表達水平則顯著升高。上述結(jié)果表明，積雪草總苷對老年FD模型大鼠的改善作用具有明顯的量效關(guān)系，高劑量積雪草總苷的作用效果普遍優(yōu)于低、中劑量組。

綜上所述，積雪草總苷能劑量依賴性地改善老年FD模型大鼠的胃腸動力不足、ENS功能異常，且以高劑量組（60 mg/kg）的作用效果最明顯;其作用機制可能與促進內(nèi)源性MTL釋放并抑制VIP分泌、抑制GDNF及下游ERK/MEK信號通路激活并促進ENS和腸神經(jīng)元修復(fù)有關(guān)。同時，基于積雪草總苷成分的復(fù)雜性[23]，后續(xù)擬從精確鑒別其有效組分、明確其作用靶點及與GDNF多重信號通路的相關(guān)性等方向進行深入研究，以期為臨床治療老年FD提供新的思路。

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（收稿日期：2019-11-25 修回日期：2020-05-09）

（編輯：段思怡）