正交試驗結合信息熵賦權法優(yōu)化千里光藥材的提取工藝

李燕 潘炎帆 張濤 韓忠耀

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）12-1470-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.12

摘 要 目的：優(yōu)化千里光藥材的提取工藝，為其進一步開發(fā)利用提供方法參考。方法：采用80 ℃水浴回流提取的方法提取千里光藥材。采用高效液相色譜法測定綠原酸和金絲桃苷的含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動相為0.2%冰醋酸水溶液-甲醇（82 ∶ 18，V/V），柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長分別為327 nm，進樣量為5 μL;采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮（以蘆丁計）和總生物堿（以苦參堿計）的含量，檢測波長分別為509、208 nm。在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數(shù)（A，%）、溶劑倍量（B，mL/g）、提取時間（C，h）、提取次數(shù)（D，次）為考察因素，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量為評價指標，通過信息熵賦權法計算上述各指標的權重系數(shù)并以此計算其綜合評分，按L9（34）正交試驗設計優(yōu)化千里光提取工藝并進行驗證。結果：千里光藥材的最佳提取工藝為加入8倍量50%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h;3次驗證試驗結果顯示，所得提取液中綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿含量的RSD均小于1.5%（n=3）。結論：優(yōu)化的提取工藝重復性好、穩(wěn)定可行，可用于千里光藥材的提取。

關鍵詞 千里光;信息熵賦權法;綠原酸;金絲桃苷;總黃酮;總生物堿;含量;正交試驗;提取工藝

Optimization of the Extraction Technology of Senecio scandens by Orthogonal Design Combined with Information Entropy Weighting Method

LI Yan，PAN Yanfan，ZHANG Tao，HAN Zhongyao（College of Pharmacy， Qiannan Medical College for Nationalities， Guizhou Duyun 558000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of Senecio scandens， and to provide reference for the further development and utilization of the medicinal material. METHODS： The method of reflux extraction with 80 ℃ water bath was used to extract S. scandens. HPLC method was adopted to determine the contents of chlorogenic acid and hyperoside. The determination was performed on Diamonsil C18 with mobile phase consisted of 0.2% glacial acetic acid water solution-methanol （82 ∶ 18， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min; the column temperature was set at 35 ℃; the detection wavelength was 327 nm， and the sample size was 5 μL. UV-Vis spectrophotometry was used to determine the contents of total flavonoids （by rutin） and total alkaloids （by matrine） and the detection wavelengths were set at 509 nm and 208 nm， respectively. Based on single factor tests， using ethanol volume fraction （A，%）， solvent folds （B， mL/g）， extraction time （C， h）， extraction times （D， times） as factors， using the contents of chlorogenic acid， hyperoside， total flavonoids and total alkaloids as indexes， and the weight coefficients of above indicator components were calculated based on information entropy weighting method so as to calculate their comprehensive scores， then L9（34） orthogonal design was used to further optimize the extraction technology. The validation tests were also performed. RESULTS： The optimal extraction technology of S. scandens included that 8-fold 50% ethanol， extracting for 3 times， lasting for 1.5 h each time. Results of 3 times of validation tests showed that RSDs of the contents of chlorogenic acid， hyperoside， total flavonoids and total alkaloids were all lower than 1.5% （n=3）. CONCLUSIONS： The optimized technology is reproducible， stable and feasible， and can be used for the extraction of S. scandens.

KEYWORDS ? Senecio scandens; Information entropy weighting theory; Chlorogenic acid; Hyperoside; Total flavonoids; Total alkaloids; Content; Orthogonal design; Extraction technology

千里光為菊科植物千里光（Senecio scandens Buch.-Ham.）的干燥地上部分，主要含黃酮、生物堿、有機酸類等化學成分，具有清熱解毒、明目退翳、殺蟲止癢、散瘀消腫等功效，被廣泛應用于各種急性炎癥的治療[1-2];同時，千里光也是多種制劑如千柏鼻炎片、千里光眼藥水、千喜片等的組方藥材，因此其主要活性成分的提取對其相關制劑的開發(fā)應用至關重要。已有研究采用總黃酮含量為單一評價指標篩選千里光提取工藝[3]，然而中藥是通過多成分、多靶點來發(fā)揮整體藥效，加之中藥成分種類眾多、含量差異大，故采用單一指標評價提取工藝優(yōu)劣具有一定的片面性，應采用多指標成分來進行工藝優(yōu)化。另外，傳統(tǒng)中藥提取工藝在確定各評價指標權重系數(shù)時通常采用主觀賦值的方法來計算綜合評分，客觀性與科學性不足。信息熵是系統(tǒng)有序程度的度量，某個屬性變異程度越大，系統(tǒng)越有序，則信息熵越小，權重系數(shù)越大;反之，則信息熵越大，權重系數(shù)小[4]。將信息熵理論應用于系統(tǒng)評價，則可使結果不受研究者主觀影響，更具有客觀性?；诖?，本研究利用信息熵賦權法評價千里光藥材提取工藝優(yōu)化過程中各指標的客觀權重系數(shù)，以期提高工藝優(yōu)化的客觀性和科學性。

相關研究表明，千里光中主要有效成分為綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿等，且在6-9月份采收的藥材中上述成分的含量較高[5-6]。因此，本研究以6-9月采集的千里光藥材為研究對象，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量為評價指標，采用L9（34）正交表進行試驗設計，結合信息熵賦權法獲得較客觀的權重系數(shù)并用以計算上述評價指標的綜合評分，旨在優(yōu)化得到千里光的最佳提取工藝，為該藥材的進一步開發(fā)利用提供方法參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀、Cary 100型雙光束紫外-可見分光光度計（美國Agilent公司）;SG-4050C型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海碩光電子科技有限公司）;PX125DZH型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對照品（批號：CHB170713，純度：≥98%）、金絲桃苷對照品（批號：CHB160904，純度：≥98%）、蘆丁對照品（批號：CHB170303，純度：≥98%）、苦參堿對照品（批號：CHB160907，純度：≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;甲醇為色譜純，乙醇、冰醋酸等其余試劑均為分析純，水為純凈水。

千里光植物采自貴州省都勻市都勻經(jīng)濟開發(fā)區(qū)老鷹坡山坡上，采集時間為2019年6-9月，每月采集2次，每次隨機采集生長良好的完整植株5株。采集植物經(jīng)黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校藥學系中藥教研室王傳明副教授鑒定為菊科植物千里光（S. scandens Buch.-Ham.）的全草，樣本保存在黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校中藥標本館。取不同月份采集的千里光地上部分切段，55 ℃下烘干，粉碎成粗粉后混合均勻，備用。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品6.55 mg、金絲桃苷對照品3.27 mg，置于同一個25 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，搖勻，即得綠原酸質量濃度為0.262 0 mg/mL、金絲桃苷質量濃度為0.130 8 mg/mL的混合對照品溶液。精密稱取蘆丁對照品8.10 mg、苦參堿對照品5.10 mg分別置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，搖勻，即得質量濃度分別為0.324 0 mg/mL的蘆丁對照品溶液和0.204 0 mg/mL的苦參堿對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，置于50 mL圓底燒瓶，加入提取溶劑后按一定的工藝條件進行回流提取，提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 綠原酸和金絲桃苷的含量測定

參照文獻方法[5，7]，采用HPLC法測定綠原酸和金絲桃苷的含量。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：0.2%冰醋酸水溶液-甲醇（82 ∶ 18，V/V）;柱溫：35 ℃;流速：1.0 mg/mL;檢測波長：327 nm;進樣量：5 μL。

2.2.2 系統(tǒng)適用性考察 取“2.1.2”“2.1.3”項下綠原酸和金絲桃苷混合對照品溶液和供試品溶液適量，以70%甲醇為空白對照，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，理論板數(shù)按綠原酸和金絲桃苷峰計均不低于8 000，空白對照無干擾（圖略），詳見圖1。

2.2.3 線性關系考察 參照文獻方法[5-8]，精密吸取“2.1.1”項下綠原酸和金絲桃苷混合對照品溶液適量，以70%甲醇稀釋制成5個質量濃度梯度的系列線性工作溶液（另設0 mg/mL的空白），按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣分析，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。結果，得綠原酸的回歸方程y=1 066.5x+0.786（r=0.999 3），金絲桃苷的回歸方程y=3 495.6x-0.748（r=0.999 1）。這表明綠原酸、金絲桃苷檢測質量濃度的線性范圍分別為0.026 2～0.262 0、0.013 1～0.130 8 mg/mL。

2.2.4 精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗 參照文獻方法[5]進行相應方法學考察。結果，上述試驗的RSD均小于1.5%（n=6），表明方法的精密度、穩(wěn)定性（室溫，36 h內）、重復性均良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 參照文獻方法[7]進行相應方法學考察。結果，綠原酸、金絲桃苷的平均加樣回收率分別為101.25%、98.62%，RSD均小于1.5%（n=6），表明方法準確度良好。

2.2.6 綠原酸和金絲桃苷的含量測定 取“2.1.2”項下供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，各樣品平行操作3次，記錄峰面積并代入“2.2.3”項下回歸方程分別計算綠原酸和金絲桃苷的含量。

2.3 總黃酮和總生物堿的含量測定

參照文獻方法[5-8]，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮（以蘆丁計）和總生物堿（以苦參堿計）的含量。

2.3.1 線性關系考察 參照文獻方法[5]，取“2.1.1”項下蘆丁對照品溶液各適量，分別進行預處理，即加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min;再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min;然后加入5%氫氧化鈉溶液10 mL，再用70%乙醇稀釋并定容至25 mL，搖勻，靜置15 min，制成5個質量濃度梯度的系列線性工作溶液（另設0 mg/mL的空白），在509 nm波長處分別檢測其吸光度。參照文獻方法[6]，取“2.1.1”項下苦參堿對照品溶液各適量，以70%乙醇稀釋制成5個質量濃度梯度的系列線性工作溶液（另設0 mg/mL的空白），在208 nm波長處分別檢測其吸光度。分別以蘆丁、苦參堿的質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、相應吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸。結果，得蘆丁的回歸方程y=7.932 4x+0.279 9（r=0.999 4）、苦參堿的回歸方程y=29.684 87x+0.055 3（r=0.999 2）。這表明蘆丁、苦參堿檢測質量濃度的線性范圍分別為0.012 9～0.064 8、0.010 2～0.051 0 mg/mL。

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗 參照文獻方法[5-7]進行相應方法學考察。結果，上述試驗的RSD均小于1.5%（n=6），表明方法的精密度、穩(wěn)定性（室溫，10 h內）、重復性均良好。

2.3.3 加樣回收率試驗 參照文獻方法[5-7]進行相應方法學考察。結果，蘆丁、苦參堿的平均加樣回收率分別為101.13%、98.30%，RSD均小于1.5%（n=6），表明方法準確度良好。

2.3.4 總黃酮和總生物堿的含量測定 取“2.1.2”項下供試品溶液，采用紫外-可見分光光度法測定（測定總黃酮時需先按“2.3.1”項下方法預處理），各樣品平行操作3次，記錄吸光度并代入“2.3.1”項下回歸方程分別計算總黃酮和總生物堿的含量。

2.4 單因素試驗篩選千里光提取工藝

參考文獻方法[8-11]，采用80 ℃水浴回流提取的方法提取千里光藥材，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿等4個指標成分的含量為指標，進行該藥材提取工藝的單因素考察。

2.4.1 提取溶劑的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行7份，固定提取次數(shù)為2次、每次提取1.5 h，分別加入10倍量（mL/g，下同）50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇作為提取溶劑進行回流提取。取提取液，按“2.1.2”項下方法濾過后，取續(xù)濾液，再按“2.2”“2.3”項下方法分別測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結果，以50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇為提取溶劑時，提取液中4種成分含量相對較高，故選擇50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇為提取溶劑進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.4.2 溶劑倍量的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行5份，分別加入5、6、8、10、20倍量的70%乙醇，回流提取2次，每次提取1.5 h。取提取液，按“2.4.1”項下方法處理并測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結果，隨著溶劑倍量的增加，提取液中4種成分的含量逐漸上升，但以10、20倍量溶劑提取后各成分的含量差異不大，故選擇溶劑倍量為6、8、10倍進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.4.3 提取時間的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行4份，加入10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次分別均提取0.5、1.0、1.5、2.0 h。取提取液，按“2.4.1”項下方法處理并測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結果，當單次提取時間為1.0、1.5、2.0 h時，提取液中4種成分含量相對較高，故選擇提取時間為1.0、1.5、2.0 h進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.4.4 提取次數(shù)的選擇 稱取千里光藥材粗粉約2 g，精密稱定，平行4份，加入10倍量70%乙醇進行回流提取，按單次提取時間為1.5 h，分別提取1、2、3、4次。取提取液，按“2.4.1”項下方法處理并測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。結果，隨著提取次數(shù)的增加，提取液中4種成分的含量均逐漸上升，但分別提取3、4次后各成分的含量差異不大，故選擇提取次數(shù)為1、2、3次進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.5 正交設計法優(yōu)化千里光提取工藝

2.5.1 因素與水平 根據(jù)單因素試驗結果并參考文獻方法[9-11]，對千里光的提取工藝進一步優(yōu)化。以乙醇體積分數(shù)（A）、溶劑倍量（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）等4個因素為考察對象，以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量為評價指標，采用L9（34）正交表進行試驗設計，再按“2.2”“2.3”項下方法測定綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿的含量。正交試驗因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

2.5.2 基于信息熵賦權計算綜合評分（M） 以綠原酸、金絲桃苷、總黃酮、總生物堿含量為評價指標，采用信息熵賦權法對各指標進行賦值并計算綜合評分，參考文獻方法[9-11]建立原始指標矩陣（X）如下：

2.5.3 正交試驗結果分析 對正交試驗進行極差分析。結果顯示，各因素對綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿含量綜合評分的影響程度大小排序為D>B>C>A，即提取次數(shù)>溶劑倍量>提取時間>乙醇體積分數(shù)，詳見表2。以極差最小的因素A作為誤差項，進行方差分析，結果見表3。

由表2可知，A1B2C2D2為最優(yōu)提取工藝;由表3可知，因素D對綜合評分的影響有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其他因素無顯著性影響（P>0.05），說明提取次數(shù)對千里光藥材的綜合提取效果有顯著影響，故因素D取其最高水平值即D3（提取3次）。因此，最終確定A1B2C2D3為千里光藥材的最佳提取工藝，即加入8倍量的50%乙醇提取3次，每次1.5 h。

2.5.4 優(yōu)化工藝的驗證試驗 根據(jù)“2.5.3”項下優(yōu)化的最佳提取工藝條件，取千里光藥材粗粉適量，平行進行3次驗證試驗。結果，綠原酸、金絲桃苷、總黃酮和總生物堿含量的RSD均小于1.5%（見表4），表明優(yōu)化所得的提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 HPLC含量測定法中流動相和檢測波長的選擇

本課題組分別比較了以磷酸水溶液-乙腈、磷酸水溶液-甲醇、冰醋酸水溶液-乙腈、冰醋酸水溶液-甲醇為流動相的分離效果。結果發(fā)現(xiàn)，當以0.2%冰醋酸水溶液-甲醇（82 ∶ 18，V/V）為流動相時，所得色譜圖的基線平穩(wěn)、分離效果好。

另外，結合文獻方法[4-5]，采用二極管陣列檢測器對供試品溶液進行掃描，結果發(fā)現(xiàn)在327 nm波長下的色譜圖基線相對平穩(wěn)，且綠原酸和金絲桃苷的響應信號均較強，并能達到有效分離，故最終確定檢測波長為327 nm。

3.2 正交試驗結合信息熵賦權法優(yōu)化提取工藝的意義

信息熵理論具有處理復雜多量數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，將試驗所得的多指標數(shù)據(jù)結果用信息熵賦權法進行處理并計算其權重系數(shù)，進而計算得到的綜合評分更加客觀，能更為科學地優(yōu)化提取工藝[10-11] 。本研究在單因素考察的基礎上，采用正交試驗對千里光藥材的提取工藝進行優(yōu)化，有效減少了試驗的次數(shù);基于信息熵賦權法計算各評價指標權重系數(shù)并此計算綜合評分，客觀、合理地反映各指標的重要程度，篩選出了較為科學、可行的最佳工藝。對此最佳工藝進行的3次驗證試驗結果顯示，4種成分含量的RSD均小于1.5%。

綜上，本研究優(yōu)化所得的提取工藝重復性好、穩(wěn)定可行，可為千里光藥材提取工藝技術參數(shù)的量化提供科學參考。

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（收稿日期：2020-02-11 修回日期：2020-05-01）

（編輯：段思怡）