超聲波-酶法提取積雪草中積雪草總苷的工藝研究Δ

張丹丹，聶緒強(qiáng)，張 涵，趙久鳳，石秀君，楊建文，2（.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563003）

超聲波-酶法提取積雪草中積雪草總苷的工藝研究Δ

張丹丹1＊，聶緒強(qiáng)1#，張 涵1，趙久鳳1，石秀君1，楊建文1，2（1.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563003）

目的：優(yōu)化積雪草中積雪草總苷的提取工藝。方法：以積雪草苷和羥基積雪草苷含量之和為考察指標(biāo)，采用單因素試驗和正交試驗對酶用量、酶解時間、酶解溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲提取時間進(jìn)行考察，優(yōu)化超聲波-酶法提取積雪草中積雪草總苷的工藝條件并進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為纖維素酶用量12mg/g，以10倍液料比加入60%乙醇，60℃酶解60 min，超聲提取50min；驗證試驗中積雪草總苷平均提取率為1.92%（RSD＝1.83%，n＝3）。結(jié)論：超聲波-酶法用于積雪草中積雪草總苷的提取，工藝穩(wěn)定、可行。

積雪草；積雪草苷；羥基積雪草苷；超聲波；纖維素酶；提取工藝；正交試驗

積雪草[Centella asiatica（L.）Urb.]為傘形科積雪草屬植物，全草入藥，是我國最早應(yīng)用的中藥之一，中醫(yī)中藥采用積雪草內(nèi)服和外用已有兩千多年的歷史，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]。2015年版《中國藥典》將積雪草收載為常用中藥材，記載其具有清熱利濕、解毒消腫的功效，主要用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、癰腫瘡毒、跌打損傷等的治療[3]。積雪草苷為積雪草的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，積雪草苷不僅具有顯著的促進(jìn)創(chuàng)面愈合、抑制瘢痕形成作用[4-5]，在治療心血管疾病、抗腫瘤、保護(hù)肝臟等方面[6-7]亦具有一定的療效。

目前積雪草苷的提取方法主要有回流法、超聲波法、微波法、酶法等。本課題組基于積雪草總苷（積雪草苷與羥基積雪草苷）的理化性質(zhì)，同時參考文獻(xiàn)[8-9]，建立超聲波-酶法提取積雪草總苷的方法，同時優(yōu)化其關(guān)鍵的提取參數(shù)，以最大程度地從積雪草藥材中提取出該有效成分。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國安捷倫科技有限公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BT125D型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；HH-SL型恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

積雪草（購于遵義藥材市場，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室楊建文教授鑒定為積雪草全草，符合2015年版《中國藥典》收載品種要求）；積雪草苷對照品（批號：PS145052301，純度：98.86%）、羥基積雪草苷對照品（批號：PS14012001，純度：99.82%）均來源于成都普思科技生物科技股份有限公司；纖維素酶（寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：201510，酶活力：40 000U/g）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 積雪草總苷的含量測定

2.1.1 對照品貯備液的制備 分別取積雪草苷和羥基積雪草苷適量，精密稱定，加甲醇制成每1m L含積雪草苷300μg、羥基積雪草苷300μg的溶液，離心（12 000 r/min，離心半徑為6.032 cm，下同）15min，取上清液即得對照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取積雪草苷提取物，加甲醇超聲（功率：300W，頻率：40 KHz）溶解，制備成含積雪草總苷為5mg/m L的溶液，12 000 r/m in離心15 min，取上清液即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件的確立 參考文獻(xiàn)[10]條件。色譜柱：ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-2 mmol/Lβ-環(huán)糊精溶液（25∶75，V/V）；流速：1.0 m L/min；檢測波長：205 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下，供試品中積雪草苷和羥基積雪草苷與相鄰主峰均達(dá)到良好的基線分離，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取積雪草苷和羥基積雪草苷貯備液，加甲醇搖勻制得含積雪草苷和羥基積雪草苷質(zhì)量濃度均為15、30、60、90、105、120、240μg/m L的混合對照品溶液，進(jìn)樣測定。以混合對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），得二者的回歸方程y＝2.281 4x（r＝0.999 6，n＝7）、y＝1.911x（r＝0.999 4，n＝7）。結(jié)果表明，積雪草苷和羥基積雪草苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為15～240μg/m L。

2.1.5 精密度試驗 取同一供試品溶液，進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，積雪草苷和羥基積雪草苷峰面積的RSD分別為0.73%、0.56%（n＝6），表明該儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密稱定同一批藥材積雪草粉末5 g，共6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果，積雪草苷和羥基積雪草苷含量的RSD分別為3.28%、3.02%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，積雪草苷和羥基積雪草苷含量的RSD分別為0.79%、0.37%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 準(zhǔn)確度試驗 精密量取已知濃度的供試品溶液9份，加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣測定。結(jié)果，積雪草苷和羥基積雪草苷的平均回收率分別為99.8%、101.8%（RSD分別為3.38%、2.27%，n＝9），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.9 樣品中積雪草總苷的含量測定 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定積雪草總苷的含量，計算積雪草總苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及積雪草總苷提取率：積雪草總苷提取率＝[積雪草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（g/g）+羥基積雪草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（g/g）]×提取物的質(zhì)量（g）/積雪草質(zhì)量（g）×100%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶用量的考察 精密稱定5.0 g積雪草粉末，5份，分別加入4、8、12、16、20mg/g纖維素酶，以液料比10∶1加入60%乙醇，50℃水浴回流加熱60m in，100℃水浴5m in滅酶。在超聲功率為300W、溫度為25℃條件下超聲提取30m in，提取液離心（3 800 r/min）15m in，取上清液備用。上清液經(jīng)干燥箱干燥后，減壓干燥至恒質(zhì)量，即得積雪草總苷提取物。按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定并計算，結(jié)果見圖2A。

圖2 各影響因素對積雪草總苷提取率的影響Fig 2 Effects of different factors on the extraction rateofasiaticosides

由圖2A可知，纖維素酶用量在4～8mg/g時，積雪草總苷提取率隨酶量增加而增加；當(dāng)纖維素酶大于8 mg/g后，積雪草總苷提取率下降。因此，選擇纖維素酶量為4、8、12mg/g進(jìn)行后續(xù)考察。

2.2.2 酶解時間考察 精密稱取5.0 g積雪草粉末，5份，分別加入8mg/g纖維素酶，以液料比10∶1加入60%乙醇，50℃水浴回流加熱40、60、80、100、120 m in，100℃水浴5 m in滅酶，超聲提取30 min。提取液同“2.2.1”項下方法處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2B。

由圖2B可知，纖維素酶最優(yōu)酶解時間為60m in。

2.2.3 酶解溫度考察 精密稱取5.0 g積雪草粉末，5份，分別加入8mg/g纖維素酶，按液料比10∶1加入60%乙醇，水浴（酶解）溫度分別為40、50、60、70、80℃，回流加熱60m in，100℃水浴5m in滅酶，超聲提取30m in。提取液同“2.2.1”項下方法處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2C。

由圖2C可知，當(dāng)酶解溫度為40～50℃時，積雪草總苷提取率呈上升趨勢，當(dāng)溫度大于50℃時，積雪草總苷提取率有所下降。因此，選擇酶解溫度為40、50、60℃進(jìn)行后續(xù)考察。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 精密稱取5.0 g積雪草粉末，5份，分別加入8mg/g纖維素酶，按液料比10∶1分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇，50℃水浴回流加熱60min，100℃水浴5m in滅酶，超聲提取30min，提取液同“2.2.1”項下方法處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2D。

由圖2D可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，積雪草總苷提取率最高。

2.2.5 液料比考察 精密稱取5.0 g積雪草粉末，5份，分別加入8mg/g纖維素酶，分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入60%乙醇，50℃水浴回流加熱60 m in，100℃水浴5m in滅酶，超聲提取30m in。提取液同“2.2.1”項下方法處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2E。

由圖2E可知，當(dāng)液料比為10∶1～15∶1時，積雪草總苷提取率隨液料比的增加而增加；當(dāng)液料比大于15∶1時，積雪草總苷提取率下降。因此，選取液料比為10∶1、15∶1、20∶1進(jìn)行后續(xù)考察。

2.2.6 超聲提取時間選擇 精密稱取5.0 g積雪草粉末，5份，分別加入8mg/g纖維素酶，以液料比15∶1加入60%乙醇，50℃水浴回流加熱60min，100℃水浴5min滅酶，分別超聲提取30、50、70、90、110m in。提取液同“2.2.1”項下方法處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2F。

由圖2F可知，當(dāng)超聲提取時間為30～50m in時，積雪草總苷提取率隨時間延長而增加；當(dāng)超聲提取時間大于50m in時，積雪草總苷提取率下降。因此，選擇超聲提取時間為30、50、70m in進(jìn)行后續(xù)考察。

2.3 正交試驗優(yōu)化積雪草總苷提取工藝

前期研究發(fā)現(xiàn)，積雪草總苷在60%乙醇中溶解度比較好，故選用乙醇作為溶劑的主要目的是其可溶解藥材中浸出的積雪草總苷，單因素試驗已篩選出了最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時間，故在正交試驗時不再對這2個因素進(jìn)行考察，而確定以酶用量（A）、酶解溫度（B）、液料比（C）和超聲提取時間（D）為考察因素，以積雪草總苷（積雪草苷和羥基積雪草苷的含量總和）提取率為評價指標(biāo)。設(shè)計L9（34）正交試驗并重復(fù)3次以確定最優(yōu)提取工藝。因素與水平見表1；正交試驗結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factorsand levels

由表2和表3可知，各因素對積雪草總苷提取率的影響大小順序為液料比＞酶解溫度＞酶用量＞超聲提取時間，其中前三者對積雪草總苷的提取工藝均有顯著影響（P＜0.05）。最終確定最優(yōu)提取工藝為A3B3C1D2，即酶用量為12mg/g、酶解溫度為60℃、液料比為10∶1、超聲提取時間為50m in。

2.4 驗證試驗

取同一批積雪草藥材粉末3份，每份200 g，按照上述最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，測定積雪草總苷提取率。結(jié)果，3次試驗中積雪草中積雪草總苷的提取率分別為1.96%、1.92%、1.89%，平均提取率為1.92%（RSD＝1.83%，n＝3），與正交試驗最高值相當(dāng)，且重現(xiàn)性較好。

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Resultsof orthogonal tests

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Resultsof variance analysis

3 討論

積雪草主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國長江以南各地廣泛分布，資源豐富，具有巨大的開發(fā)潛力。近年來，對積雪草結(jié)構(gòu)鑒定和活性研究取得諸多進(jìn)展，但有很多問題尚待解決，如其主要活性成分在天然產(chǎn)物中含量偏低、提取利用率低等。張開蓮等[8]以積雪草苷和羥基積雪草苷為考察指標(biāo)，比較了超聲提取、索氏回流和加熱回流3種提取方法對積雪草總苷提取率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲提取積雪草總苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，提取率為0.427%，但提取效率仍不高；陳瑤等[11]發(fā)現(xiàn)藥材與75%乙醇的料液比為1∶20時，超聲提取積雪草總苷含量最高，為1.25%，但此提取方法相關(guān)要求較多。

植物中的有效成分往往被包裹于細(xì)胞壁內(nèi)難以溶出，如果對細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，則有利于內(nèi)容物的溶出。超聲波以一種機(jī)械的方法將細(xì)胞壁破碎，可以增大物質(zhì)運動分子的運動頻率和速度，增加溶劑的滲透性，從而加速內(nèi)容物進(jìn)入溶劑[12]，促進(jìn)積雪草總苷的溶出。酶對藥材細(xì)胞壁有降解作用。酶的種類很多，包括纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等，均能破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。韓偉等[13]運用酶法提取積雪草苷時對纖維素酶、果膠酶、蛋白酶進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以纖維素酶提取效果最優(yōu)；樊亮等[14]在提取積雪草總苷時也是采用纖維素酶進(jìn)行提取。故本試驗也選擇纖維素酶進(jìn)行提取。

為節(jié)約時間、降低工藝成本，本試驗通過超聲波輔助纖維素酶法對積雪草總苷進(jìn)行提取，希望通過二者的結(jié)合可以更好地破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，增加有效成分的穿透能力，促進(jìn)積雪草總苷的溶出。結(jié)果表明，與積雪草總苷其他常規(guī)提取法比較，超聲波輔助酶法能耗低、提取率較高，且耗時短，可降低生產(chǎn)成本。

[1] 賈廣韜.積雪草苷的提取、分離純化與水解[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[2] 陳俊，張曉龍，楊時.高純度積雪草總苷的制備工藝研究[J].中草藥，2014，45（4）：504-508.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：283-284.

[4] Qi SH，Xie JL，Pan S，etal.Effects of asiaticoside on the expression of Smad protein by normal skin fibroblasts and hypertrophic scar fibroblasts[J].Clin Exp Dermatol，2008，33（2）：171-175.

[5] Song J，DaiY，Bian D，etal.Madecassoside inducesapoptosis of keloid fibroblasts via am itochondrial-dependent pathway[J].Drug Develop Res，2011，72（4）：315-322.

[6] Belcaro G，Dugall M，HosoiM，et al.Pycnogenol?and Centella Asiatica for asymptomatic atherosclerosis progression[J].IntAngiol，2014，33（1）：20-26.

[7] Marques NF，Stefanello ST，F(xiàn)roeder AL，et al.Centella asiatica and its fractions reduces lipid peroxidation induced by quinolinic acid and sodium nitroprusside in rat brain regions[J].Neurochem Res，2015，40（4）：1197-1210.

[8] 張開蓮，張煒.正交試驗優(yōu)化積雪草總苷的提取工藝[J].中國藥房，2008，19（21）：1618-1620.

[9] 張煒.積雪草總苷提取工藝和含量測定研究[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，31（5）：498-500.

[10] 劉宇，陳璐.高效液相色譜法測定三金膠囊中積雪草苷和羥基積雪草苷的含量[J].中國藥業(yè)，2013，22（22）：61-62.

[11] 陳瑤，韓婷，秦路平，等.正交設(shè)計法優(yōu)選積雪草總苷的提取方法[J].中藥材，2003，26（3）：24-25.

[12] 葉陳麗，賀帥，曹偉靈，等.中藥提取分離新技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（3）：257-464.

[13] 韓偉，陳惠丹，樊亮，等.酶法提取積雪草苷[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，31（3）：18-22.

[14] 樊亮，王承瀟，陳惠丹，等.用酶解預(yù)處理-微波法提取積雪草總苷[J].華東理工大學(xué)學(xué)報，2009，35（4）：591-595.

Study on the Extraction Technology of Asiaticosides from Centella asiatica by Ultrasonic-enzyme M ethod

ZHANG Dandan1，NIE Xuqiang1，ZHANG Han1，ZHAO Jiufeng1，SHI Xiujun1，YANG Jianwen1，2（1.College of Pharmacy，Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563003，China；2.A ffiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi563003，China）

OBJECTIVE：To optim ize the extraction technology of asiaticosides from Centella asiatica.METHODS：Using total amounts of asiaticoside and hydroxy asiaticoside as investigation indexes，single factor and orthogonal testwere used to investigate the enzyme amount，enzymolysis time，enzymolysis temperature，ethanol volume fraction，liquid material ratio and ultrasonic extraction time and optimize the extraction technology of asiaticosides from C.asiatica by ultrasonic-enzymemethod，and verification testwas conducted.RESULTS：Optimal extraction technology was as follow as cellulose dosage of 12mg/g，10-fold liquidmaterial ratio added into 60%ethanol，enzyme hydrolysis for 60 m in at 60℃，ultrasonic assisted extraction for 50 m in.Average extraction rate of total asiaticosideswas 1.92%（RSD＝1.83%，n＝3）in verification test.CONCLUSIONS：Ultrasonic-enzymemethod is stable and feasible for the extraction technology of asiaticosides from C.asiatica.

Centella asiatica；Asiaticoside；Hydroxy asiaticoside；Ultrasonic；Cellulose；Extraction technology；Orthogonal test

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1816-04

2016-09-09

2017-02-18）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81560712）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（No.黔科合LH字〔2014〕7566號）；貴州省科技計劃課題（No.黔科合重大專項字〔2015〕6010）

＊碩士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0851-28642516。E-mail：1450024131@qq.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：生藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及活性成分分析。電話：0851-28642516。E-mail：niexuqiang@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.25