脊髓損傷恒河猴下肢殘留跨步能力的評估

趙璨，魏瑞晗，趙文，季潤，饒家聲1,，楊朝陽，李曉光,

1.北京航空航天大學生物醫(yī)學工程高精尖創(chuàng)新中心，北京市 100083；2.北京航空航天大學儀器科學與光電工程學院測控與信息技術(shù)系，北京市 100083；3.北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院生物材料與神經(jīng)再生北京市重點實驗室，北京市 100083；4.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院神經(jīng)生物學系，北京市 100069；5.國家康復輔具研究中心人體生物力學實驗室，北京市100176

脊髓損傷是中樞神經(jīng)損傷的一種，它會導致脊髓內(nèi)長程傳導束的斷裂，從而引發(fā)運動功能部分或完全喪失。由于成年哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自發(fā)恢復能力極其貧乏[1]，因此脊髓損傷導致的運動功能缺失往往是永久且不可逆轉(zhuǎn)的。

研究脊髓損傷最主要的指標是殘留運動功能輸出的恢復，它能夠最直觀地反映脊髓損傷的受損程度或治療效果。其中，非人靈長類脊髓損傷運動評估對于闡明脊髓傳入通路的完整性及腦-脊髓結(jié)構(gòu)的作用等方面具有重要意義。有研究通過對非人靈長類在開放場中的運動表現(xiàn)評估脊髓損傷后的下肢/四肢運動輸出，從而評估細胞/介入治療方案的效果[2-3]。然而，這些研究依賴于觀察者的主觀評估，對運動輸出的變化不夠敏感和精確。最近的研究開始將雙足行走的動物模型引入脊髓損傷后的運動評價中，通過分析雙足行走的足跡[4]、足底壓力[5]或雙足運動的步態(tài)[6-8]來反映動物在脊髓損傷后的運動功能變化。其中，步態(tài)分析方法能夠通過大量參數(shù)獲得更為準確、客觀的步態(tài)特征，進而展現(xiàn)中樞神經(jīng)損傷對步態(tài)特征的影響，因此在脊髓損傷后的運動評估中具有顯著優(yōu)勢。

另一方面，步態(tài)分析在臨床研究中已被廣泛用于評估由神經(jīng)系統(tǒng)疾病所導致的步態(tài)異常或運動障礙，為分析步態(tài)異常的原因和制定治療/康復的方案提供實驗依據(jù)[9]?；诖?，從非人靈長類雙足運動的評估中得到的步態(tài)數(shù)據(jù)在向臨床應用轉(zhuǎn)化。

本研究采用步態(tài)分析方法縱向評估恒河猴在脊髓損傷前及損傷后6 周和12 周時的步態(tài)表現(xiàn)，獲取不同時間點的步態(tài)特征并進行分析，探索脊髓部分損傷后非人靈長類雙下肢運動功能隨時間的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性成年恒河猴4 只，體質(zhì)量(5±1)kg，年齡4～6歲，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。實驗流程經(jīng)過首都醫(yī)科大學實驗動物福利與倫理委員會的審核批準。

1.2 運動訓練范式

所有恒河猴在正式實驗前均進行適應性訓練3次，在跑步機上完成約束條件下的雙足跨步運動，每周1次。實驗動物被保定于特制的固定裝置上，雙足站立于靜止的跑步機上，適應10～20 min 之后開始跨步運動。訓練過程采用正反饋機制讓動物學習移動雙下肢來完成行走。跑步機速度0.8 km/h。如果恒河猴能夠連續(xù)行走10 步以上就給予果汁獎勵，連續(xù)完成10 次10步以上的跨步行走即可完成當次訓練。

1.3 脊髓損傷手術(shù)

恒河猴脊髓半側(cè)移除模型由專業(yè)外科醫(yī)生執(zhí)行，無菌環(huán)境下完成。術(shù)前肌肉注射鹽酸氯胺酮注射液10 mg/kg 誘導麻醉，隨后肌肉注射鹽酸塞拉嗪溶液5 mg/kg 維持麻醉，術(shù)中靜脈持續(xù)注射氯化鈉葡萄糖溶液40 滴/min。暴露胸椎T7-9節(jié)段，手術(shù)顯微鏡下切開硬脊膜暴露脊髓，以脊髓中央后靜脈作為脊髓中線標志，在右半側(cè)切除脊髓組織1 cm，造成脊髓半側(cè)損傷。術(shù)后3～5 d 內(nèi)，動物肌肉注射頭孢唑林30 mg/kg和丁丙諾啡0.15～0.3 mg/kg以預防感染。

恒河猴在標準猴籠中單獨飼養(yǎng)，任意獲取新鮮蔬果、猴糧及干凈的水。所有動物術(shù)后均被嚴格檢測，尤其是排尿、排便情況。飼養(yǎng)室內(nèi)保持溫度23～26 ℃、濕度35%～45%。

1.4 步態(tài)測試

分別在脊髓損傷前、脊髓損傷后6 周和12 周進行步態(tài)測試。步態(tài)測試前，恒河猴以與訓練期同樣的狀態(tài)被保定于固定裝置，隨后將熒光標記點固定于雙側(cè)髂前上棘、髂后上嵴、大腿、膝關(guān)節(jié)、小腿、踝關(guān)節(jié)、足后跟、足趾，共16個點。其中，大腿標記點的位置為大轉(zhuǎn)子到膝關(guān)節(jié)總長度的上2/3 處，小腿標記點的位置為膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)連線的中點，足趾標記點的位置為足中指第二跖骨關(guān)節(jié)處，其余標記點均貼于相應骨性解剖位置。采用VICON 系統(tǒng)(Vicon 8,Oxford Metrics Limited,UK)采集下肢步態(tài)數(shù)據(jù)，采集頻率為100 Hz。測試中，動物在速度0.8 km/h 跑步機上行走，連續(xù)行進＞10步的數(shù)據(jù)被保留。

1.5 步態(tài)數(shù)據(jù)處理及分析

實驗動物進行雙足行走時共有6 個紅外攝像機進行拍攝，VICON 系統(tǒng)將所有攝像機傳回的2D 信號重新整合，構(gòu)建一個3D 空間并實時記錄每個熒光標記點的3D 空間坐標值。同時該系統(tǒng)能夠根據(jù)各個點的空間位置構(gòu)建恒河猴下肢的肢體及關(guān)節(jié)模型(圖1)以模擬動物的運動軌跡。根據(jù)采集到的所有熒光標記點實時3D 坐標值，計算步態(tài)參數(shù)，包括步態(tài)周期時長、步長、步高、膝/踝關(guān)節(jié)角度幅值等。

跨步是一個復雜的運動，肢體各節(jié)段、關(guān)節(jié)之間會互相影響，因此各步態(tài)參數(shù)之間也會相互影響?；诖?，將可能存在關(guān)聯(lián)影響的參數(shù)設(shè)為聯(lián)動參數(shù)，即，步長和步高視為一對聯(lián)動參數(shù)，踝關(guān)節(jié)屈曲/伸展幅值和膝關(guān)節(jié)屈曲/伸展幅值視為一對聯(lián)動參數(shù)。

與人類不同，恒河猴為趾行性動物，即邁步時不是足跟落地而是足趾先觸地。因此，在本研究中恒河猴的一個完整的步態(tài)周期被定義為單側(cè)肢體一次足趾觸地到下一次足趾觸地的過程。而步態(tài)周期時長即動物在跨步過程中單側(cè)肢體從足趾離地到下一次足趾離地所用時長。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 步態(tài)協(xié)調(diào)性

脊髓損傷前，所有動物雙足均能完成連續(xù)跨步，同時雙足間跨步為交替進行，協(xié)調(diào)性良好。單側(cè)肢體的整個步態(tài)周期可以進一步細化為雙站立期-單站立期-雙站立期-擺動期，與人類步態(tài)極大相似。同時每只動物雙側(cè)肢體的各個步態(tài)周期時長較為均勻，雙側(cè)步態(tài)穩(wěn)定。

脊髓損傷后6 周，患側(cè)均沒有觀察到明顯的擺動期，肢體始終處于拖拽狀態(tài)，無法完成完整的跨步。同時，肢體間的協(xié)調(diào)性也受到極大影響，兩側(cè)肢體沒有觀察到任何交替步態(tài)，患側(cè)肢體是在健側(cè)肢體的帶動下被動運動，而非主動邁步。

脊髓損傷后12 周，患側(cè)肢體的運動功能仍然缺失，盡管有部分動物能夠偶爾完成不連續(xù)跨步，但患側(cè)肢體仍然處于拖拽狀態(tài)，未觀察到明顯的擺動期。但雙側(cè)協(xié)調(diào)性較脊髓損傷后6 周有輕微的恢復。見圖2。

脊髓損傷前，所有動物的步態(tài)周期時長為(1.51±0.07) s，其中站立期(0.89±0.07) s，擺動期(0.62±0.03)s。脊髓損傷后6 周和12 周，步態(tài)周期時長均顯著增加(P＜0.001)；6 周和12 周間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 關(guān)節(jié)角度變化

由于脊髓損傷后患側(cè)肢體始終未完成完整的步態(tài)，無法采集到足夠的步態(tài)參數(shù)來進行分析，因此僅對健側(cè)肢體的步態(tài)進行分析。

圖1 恒河猴脊髓損傷后健側(cè)下肢一個步態(tài)周期的3D棍棒模型

圖2 恒河猴脊髓損傷前后連續(xù)5個步態(tài)周期雙側(cè)下肢步態(tài)協(xié)調(diào)性

所有恒河猴在健康時期膝/踝關(guān)節(jié)均呈近似“w”的曲線分布，與人類步行膝踝關(guān)節(jié)屈曲/伸展變化類似。最大膝/踝關(guān)節(jié)伸展均出現(xiàn)在擺動期末尾，第二個波峰出現(xiàn)在擺動期起始，而最大膝/踝關(guān)節(jié)屈曲則出現(xiàn)在擺動期中期，且在站立期中期膝關(guān)節(jié)屈曲/伸展曲線中能觀察到明顯的平臺期。但與人類相比，由于恒河猴的雙足運動呈屈膝屈髖模式，因此其屈曲伸展的幅值較人類更小。脊髓損傷后，恒河猴下肢膝/踝關(guān)節(jié)整體的屈曲/伸展模式未發(fā)生改變，仍然呈類似“w”的曲線分布，但其在擺動期內(nèi)的曲線變化更為陡峭，波峰波谷更明顯，且整體的變化幅值偏大。見圖3。

表1 不同時間恒河猴步態(tài)周期時長比較(s)

脊髓損傷6 周和12 周，健側(cè)一個完整的步態(tài)周期內(nèi)踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的屈曲/伸展幅值均顯著增加(P＜0.001)，兩時間點間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 步態(tài)參數(shù)聯(lián)動變化

脊髓損傷前后恒河猴健側(cè)步長/步高、膝關(guān)節(jié)角度變化幅值/踝關(guān)節(jié)角度變化幅值均無顯著性差異(P＞0.05)。但聯(lián)動參數(shù)在脊髓損傷后6 周的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性明顯弱于損傷前，損傷后12周其數(shù)據(jù)穩(wěn)定性有一定程度的恢復。見表3。

2.4 步態(tài)參數(shù)相關(guān)性

左側(cè)步態(tài)周期時長與步長(r=0.838,P=0.001)、步高(r=0.726,P=0.007)和踝關(guān)節(jié)角度變化幅值(r=0.766,P=0.004)均呈正相關(guān)，踝關(guān)節(jié)角度變化幅值與步長呈正相關(guān)(r=0.627,P=0.029)。膝關(guān)節(jié)角度變化幅值與其他步態(tài)參數(shù)不相關(guān)(P＞0.05)。

表2 脊髓損傷前后恒河猴健側(cè)踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的屈曲/伸展幅值比較(°)

表3 脊髓損傷前后健側(cè)恒河猴步態(tài)參數(shù)聯(lián)動變化

圖3 恒河猴健側(cè)肢體脊髓損傷前后膝/踝關(guān)節(jié)角度幅值變化

3 討論

已有眾多關(guān)于嚙齒類動物的研究探索脊髓損傷與運動功能之間的關(guān)系以及損傷后運動功能恢復的進程[10-12]，這些研究為脊髓損傷的運動功能評估提供了實驗基礎(chǔ)。然而，對于嚙齒類動物來說，即便是嚴重的脊髓損傷，其運動功能的高自發(fā)恢復率也可能會過度預測殘留/新生白質(zhì)對運動輸出的貢獻[2]。尤其是將相關(guān)研究的結(jié)論轉(zhuǎn)化至非人靈長類或人類研究時，其可靠性和安全性均受到一定的制約。

近年來有大量健康非人靈長類運動分析的研究。Goetz 等[13]展示了限制條件下健康非人靈長類雙下肢行走的步態(tài)模式與人類類似，由連續(xù)交替的站立期(單站立期和雙站立期)和擺動期構(gòu)成。本研究4 只恒河猴在脊髓半側(cè)移除術(shù)前也都觀察到完全一致的步態(tài)模式。脊髓損傷后，患側(cè)肢體均無法完成跨步，這是由半側(cè)皮質(zhì)脊髓束輸出中斷造成的。健側(cè)肢體雖然能夠完成連續(xù)步態(tài)，但與脊髓損傷前相比，膝/踝關(guān)節(jié)屈曲伸展的幅值在擺動期內(nèi)顯著增加，提示脊髓損傷后恒河猴能夠通過增加膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)的屈曲伸展幅度來完成步態(tài)周期。健側(cè)肢體在脊髓損傷后采用這樣的跨步策略，可彌補患側(cè)肢體承重能力和擺動缺失所帶來的負面影響。還有研究顯示[14-15]，當跑步機速度增加時，健康恒河猴的雙足運動并不會通過增加步頻來適應更高的速度，而是在擺動期時長保持穩(wěn)定的同時，以膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)屈伸幅度的增加完成更高速的步行，而保持基本恒定的步頻。本研究中，在速度不變的情況下，脊髓損傷后恒河猴的健側(cè)肢體同樣在保持擺動期基本不變的情況下，擺動期內(nèi)膝/踝關(guān)節(jié)的屈曲伸展幅值增加，從而步頻降低。提示脊髓損傷后動物的健側(cè)肢體在跑步機上展現(xiàn)出的“步態(tài)策略”與健康動物在高速跑步機上所采用的策略一致。通過這種“步態(tài)策略”，動物能夠獲得更為有效的步伐，從而補償患側(cè)下肢運動功能的不足。

雖然脊髓損傷會導致動物的步態(tài)策略發(fā)生改變，但關(guān)聯(lián)參數(shù)如步長/步高或膝/踝關(guān)節(jié)屈曲伸展幅值之間的協(xié)變性(如變化的程度和趨勢)顯示高度的穩(wěn)定性。提示健側(cè)肢體的各個部分(大腿、小腿、足及各個關(guān)節(jié)等)之間的內(nèi)在耦合并沒有受到損傷的影響，這可能也是健側(cè)下肢在脊髓損傷后仍然能夠維持跨步能力的根本原因。這意味著脊髓損傷后，健側(cè)下肢的上層運動控制(腦)并沒有受損，并及時根據(jù)肢體運動缺失的情況代償性調(diào)整運動策略，以維持殘留的運動能力。

有研究報道[17]，雙足運動獼猴隨著跑步機速度增加而單調(diào)增加跨步長度和頻率。Ogihara等[18]發(fā)現(xiàn)，周期時長隨速度的增加而減少，跨步長度增加。本研究中，跑步機速度恒定時，步態(tài)周期時長和步長、步高和踝關(guān)節(jié)角度幅值呈正相關(guān)。提示步態(tài)周期時長可能是脊髓損傷后的運動學分析中的一個關(guān)鍵性參數(shù)。

此外，脊髓損傷后12周，健側(cè)肢體的參數(shù)趨于穩(wěn)定。同時，在脊髓損傷后6 周不能完成任何跨步運動的患側(cè)在12周時也能觀察到偶發(fā)的不完整步態(tài)。這與之前的研究結(jié)果[19]相結(jié)合，意味著脊髓損傷導致的一系列病理進程(變化/事件)在12周趨于穩(wěn)定，甚至有一定程度的恢復。運動通路內(nèi)在的可塑性或殘留白質(zhì)的軸突出芽，新的神經(jīng)回路的形成[20-21]，脊髓結(jié)構(gòu)之間的連接重組[22]等事件可能均為這一現(xiàn)象做出貢獻。然而，潛在的神經(jīng)生理機制仍需進一步的研究。

本研究還存在一定的局限性。首先，不同于臨床美國脊髓損傷協(xié)會評分及大鼠BBB評分，步態(tài)運動學分析對受試對象的身體狀況有一定要求，因此完全損傷或超急性期內(nèi)的受試對象，以及有其他外傷影響運動的受試對象可能無法完成測試。其次，本研究只選取損傷后6 周和12 周兩個時間點進行運動學測試及分析，12周之后由脊髓損傷誘發(fā)的功能可塑性和運動恢復可能仍在進行之中，因此需要更為全面且更長時程的研究。最后，本研究使用的是T7-9節(jié)段半側(cè)切除的恒河猴模型，未來應選取更為接近臨床的挫傷模型或介入治療模型進一步研究。