識別免疫復(fù)合物的納米肽研究進展

劉細霞，陳思銳，侯建軍

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學(xué) 生物學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，湖北 黃石 435002)

0 引言

食品中小分子危害物的殘留是影響食品安全的主要因素之一，給人類健康造成了極大的威脅[1]。免疫分析技術(shù)在小分子危害物監(jiān)測領(lǐng)域占有舉足輕重的地位，已成功應(yīng)用于多種小分子危害物的快速檢測[2]。由于小分子危害物往往只有一個抗原決定簇，難以利用經(jīng)典的雙抗體夾心法對其進行檢測，因此目前對其分析主要采用的是競爭免疫分析模式，但競爭免疫分析模式的靈敏度及線性范圍一般難以滿足痕量水平的檢測需求。為克服這一缺陷，研究者們不斷探索創(chuàng)新，建立了基于抗獨特型抗體的非競爭免疫分析[3]、基于抗異型抗體的非競爭免疫分析[4]、基于抗體可變區(qū)片段的非競爭免疫分析[5]及抗免疫復(fù)合物多肽的非競爭免疫分析[6]等方法。研究表明，這些非競爭免疫分析模式在小分子檢測中顯示出了高靈敏度、寬線性范圍、低性噪比等優(yōu)點，確實能在一定程度上彌補競爭免疫分析模式的不足之處。其中，基于納米肽建立的識別免疫復(fù)合物非競爭免疫分析法中，因納米肽有制備周期短、易改造等優(yōu)點，備受研究者關(guān)注，成為促進小分子危害物非競爭免疫分析技術(shù)快速發(fā)展的重要識別分子。本文就識別免疫復(fù)合物的納米肽篩選技術(shù)和基于納米肽的檢測技術(shù)研究進展進行綜述。

1 識別免疫復(fù)合物的納米肽篩選技術(shù)及發(fā)展趨勢

1985年，科學(xué)家George P.Smith開發(fā)了噬菌體展示技術(shù)，利用噬菌體展示技術(shù)進行了抗體的定向進化[7]。后來該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)的篩選，并于2018年獲得諾貝爾化學(xué)獎。從2007年開始，美國加州大學(xué)戴維斯分校Hammock教授研究組[6]建立了噬菌體展示納米肽庫的篩選技術(shù)，篩選過程如圖1所示。該技術(shù)的基本原理是將納米肽的編碼基因片段插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在不影響外殼蛋白正常功能的情況下，實現(xiàn)外源納米肽與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨著下一代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。展示的納米肽不僅能保持基因型與表現(xiàn)型一致，而且還可以保持相對獨立的生物功能和空間結(jié)構(gòu)，有利于靶分子的識別與結(jié)合。再用酸或競爭靶標洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪親和結(jié)合，經(jīng)過多輪的“親和結(jié)合—洗滌—洗脫—擴增”后，噬菌體展示文庫就能得到高度富集。然后，對單個的活性納米肽進行功能評價，從而找到系列有識別功能的納米肽?，F(xiàn)有研究均采用噬菌體展示技術(shù)篩選識別免疫復(fù)合物的納米肽，但該技術(shù)易受體內(nèi)轉(zhuǎn)化效率的影響，在篩選成功率方面受到局限。因此，構(gòu)建新型識別免疫復(fù)合物的納米肽篩選技術(shù)將有助于彌補篩選成功率不高的問題。1997年，瑞士蘇黎世大學(xué)生物化學(xué)研究所[8]和英國劍橋大學(xué)貝克翰研究所[9]發(fā)表了利用核糖體展示技術(shù)篩選單鏈抗體的研究成果。該技術(shù)屬于體外篩選技術(shù)，不需體內(nèi)轉(zhuǎn)化、庫容量大，是一種有前景的識別分子篩選技術(shù)。同時，利用該技術(shù)也已獲得抗導(dǎo)電聚合物肽[10]、抗鏈霉親和素光響應(yīng)肽[11]等。本課題組構(gòu)建了基于核糖體展示技術(shù)篩選納米肽的平臺，篩選原理如圖2所示。通過將正確折疊的納米肽及mRNA同時結(jié)合在核糖體上，形成納米肽-mRNA-核糖體三聯(lián)體，使納米肽的基因型和表型聯(lián)系起來。經(jīng)與靶標特異性結(jié)合后，洗滌去除未與靶標結(jié)合的三聯(lián)體，再利用原位反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)獲得特異性納米肽對應(yīng)的基因型，從而實現(xiàn)納米肽文庫的富集篩選。一般經(jīng)過5～12輪連續(xù)篩選，即可獲得具有特異性識別功能的納米肽。

圖1 噬菌體展示原理圖

圖2 核糖體展示原理圖

2 基于識別免疫復(fù)合物納米肽建立的檢測技術(shù)研究進展

與競爭免疫分析相比，非競爭免疫分析靈敏度更高。然而，要實現(xiàn)小分子危害物的非競爭免疫分析，識別分子的制備是關(guān)鍵?，F(xiàn)有研究顯示，識別免疫復(fù)合物的納米肽可用于建立小分子危害物的非競爭免疫分析，并用于實際樣品檢測。自2007年，加州大學(xué)戴維斯分校Hammock Bruce D.教授研究組和烏拉圭國立大學(xué)Gonzalez-Sapienza教授研究組率先發(fā)現(xiàn)識別免疫復(fù)合物納米肽，可建立識別小分子危害物的高靈敏非競爭免疫分析方法?，F(xiàn)已報道識別草達滅[12～14]、異惡草酮[15,16]、隱孔雀石綠[17]、苯氧基苯甲酸[18,19]、莠去津[20]、苯噻菌酯[21]、溴化二苯醚47[22,23]免疫復(fù)合物的納米肽?；谶@些納米肽建立的非競爭免疫分析方法類型、半飽和濃度及檢測限如表1所示?？傮w可分歸為兩大類非競爭免疫分析模式：酶聯(lián)免疫吸附法(噬菌體酶免疫吸附法、側(cè)流層析法原理類似，歸為同一類)和噬菌體抗免疫復(fù)合物—實時熒光定量聚合酶鏈法。

2.1 基于納米肽的非競爭酶聯(lián)免疫吸附法

基于納米肽建立的非競爭酶聯(lián)免疫吸附法是最常用的一種非競爭免疫分析模式，該方法以酶聯(lián)免疫吸附分析為基礎(chǔ)，在檢測過程中引入識別免疫復(fù)合物的納米肽從而實現(xiàn)小分子的非競爭檢測，該方法的檢測流程如圖3所示。Vanrell等[12]將前期篩選到的納米肽進行人工合成，建立了非競爭模式的側(cè)流層析法快速檢測草達滅和異惡草酮。該方法的檢測結(jié)果可通過肉眼觀察，對這兩種小分子的最低檢測限均為2.5 ng/mL.Lassabe等[13]和Carlomagno等[16]分別將抗異惡草酮的納米肽與志賀氏菌毒素B亞單位、鏈霉親和素融合表達，建立了無噬菌體非競爭免疫分析法，其靈敏度比相應(yīng)的競爭法分別高10倍和8倍；González-Techera等[20]基于莠去津納米肽-噬菌體建立了電化學(xué)免疫傳感器非競爭免疫分析方法，該方法的靈敏度為0.2 pg/mL，比競爭免疫分析的靈敏度高200倍；我國科研人員對識別免疫復(fù)合物的納米肽研究起步較晚，Dong等[17]篩選獲得可識別隱孔雀石綠免疫復(fù)合物的納米肽，基于噬菌體納米肽建立的非競爭免疫分析方法比基于親本抗體的競爭免疫分析方法靈敏度提高了16倍。Hua等[21]建立了可識別苯噻菌酯免疫復(fù)合物的非競爭免疫分析方法，該方法的半飽和濃度(SC50)為2.27 ng/mL，方法的選擇性好。Wang等[23]篩選獲得識別四溴二苯醚免疫復(fù)合物的納米肽，基于納米肽建立的非競爭免疫分析方法的SC50為4.2 ng/mL，比競爭免疫分析方法的IC50值低。綜上所述，基于識別免疫復(fù)合物建立的非競爭免疫分析技術(shù)靈敏度均有明顯提高，建立的方法均以免疫分析為基礎(chǔ)，只是將識別分子抗體用納米肽代替。但技術(shù)的發(fā)展相對緩慢，主要是缺乏豐富的識別小分子危害物免疫復(fù)合物的納米肽。因此，未來急需通過技術(shù)提升，增加納米肽的種類，進而促進這種新型非競爭免疫分析技術(shù)在實際樣品分析和商業(yè)化試劑盒產(chǎn)品開發(fā)中發(fā)揮作用。

表1 識別小分子危害物的納米肽

2.2 噬菌體抗免疫復(fù)合物-實時熒光定量聚合酶鏈法

免疫聚合酶鏈法(Immuno polymerase chain reaction, IPCR)是一種基于抗體良好的親和力和特異性，結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的強大信號擴增，比經(jīng)典免疫分析具有更高敏感度的分析技術(shù)。Kim等[14]提出了一種新型的IPCR，稱為噬菌體抗免疫復(fù)合物實時PCR(PHAIA-PCR)，用于檢測小分子，該方法的檢測流程如圖4所示。首先，基于噬菌體抗免疫復(fù)合物分析(PHAIA)技術(shù)，在M13噬菌體表面顯示的短肽環(huán)與抗體-靶標免疫復(fù)合物特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)小分子的非競爭分析。編碼該肽的噬菌體DNA可以通過PCR擴增，該方法消除了半抗原功能化或DNA模板的生物結(jié)合，且提高了靈敏度。為驗證該方法，將PHAIA-PCR法用于3-苯氧基苯甲酸和草達滅的檢測。結(jié)果顯示，PHAIA-PCR對苯氧基苯甲酸和草達滅的最低檢測限分別為20 pg/mL和0.2 ng/mL，PHAIA-PCR的靈敏度比傳統(tǒng)的PHAIA提高了10倍，反應(yīng)速度也顯著提高。采用該方法對農(nóng)業(yè)排水和人體尿液樣本進行驗證，表明其對快速監(jiān)測人體暴露或環(huán)境污染是可行的。由此可見，PHAIA-PCR法是一種高靈敏分析方法，且借助噬菌體上的DNA可實現(xiàn)方法的通用化，有較好的應(yīng)用前景。

圖3 非競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測流程圖

圖4 噬菌體抗免疫復(fù)合物-實時熒光定量聚合酶鏈法檢測流程圖

3 展望

基于識別免疫復(fù)合物的納米肽建立非競爭免疫分析系統(tǒng)，是今后開發(fā)針對小分子危害物高靈敏檢測技術(shù)的重要發(fā)展方向。當(dāng)今，識別免疫復(fù)合物的納米肽篩選技術(shù)發(fā)展十分緩慢，制約該領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵因素之一是篩選技術(shù)單一。雖然噬菌體展示技術(shù)在制備納米肽時表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢，但該技術(shù)不僅對操作人員的要求高、篩選成本高。同時，在篩選過程中缺少實時監(jiān)測，容易出現(xiàn)篩選不到活性納米肽的情況。因此，完善納米肽篩選環(huán)節(jié)中的肽庫設(shè)計，篩選策略，以及探索新型篩選技術(shù)，將有助于豐富納米肽種類，從而加快小分子危害物非競爭免疫分析技術(shù)發(fā)展。