蝦苗場3種重要病原同步定量PCR 檢測技術的建立

李楠英，房文紅，王 元，馬清揚，李新蒼，趙 姝，符貴紅，周俊芳

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業(yè)農村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

引進品種凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）因為生長速度快、適應性強，其種苗培育和養(yǎng)殖產業(yè)在我國得到持續(xù)發(fā)展，成為我國重要水產養(yǎng)殖經濟品種。然而，隨著混養(yǎng)與集約化等多種模式的開發(fā)和國內外蝦類產品與苗種流通的增加，我國凡納濱對蝦病原種類呈現(xiàn)增多趨勢，如白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）、偷死病野田村病毒（covert mortality nodavirus，CMNV）、桃拉綜合征 病 毒 （Taura syndrome virus，TSV）、黃頭病毒（yellow head virus，YHV）、傳染性肌肉壞死病毒（infectious myonecrosis virus，IMNV）和最近發(fā)生的蝦虹彩病毒（decapod iridescent virus 1，DIV1）等病毒性病原［1-2］、蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）等寄生蟲性病原［3］，以及副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈維弧菌（V.harveyi）和氣單胞菌（Aeromonassp.）等細菌性病原［4-7］。其中，WSSV、IHHNV、TSV、YHV、IMNV所致疾病被農業(yè)部動物疫病名錄（2013）列為二類疫病；盡管EHP、DIV1和致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（V.parahaemolyticusAHPND，VpAHPND）為近幾年新發(fā)的病原，但是這幾種病原對對蝦養(yǎng)殖造成的經濟損失卻非常嚴重，已經成為蝦類養(yǎng)殖業(yè)的重要威脅［8-11］。鑒于對蝦病原種類的多樣性、危害嚴重性以及許多養(yǎng)殖病害的暴發(fā)源于病原對種苗的微量感染等，近年來生物安保育苗技術在大型對蝦育苗場逐步推廣［12］，部分病原的發(fā)病率和暴發(fā)程度得到明顯控制，如TSV和IHHNV的檢出率大幅降低，WSSV也從20世紀末的一類疫病降為二類疫病。筆者近幾年在上海、海南和福建等省市的幾家大型凡納濱對蝦育苗場對常見病原的檢測結果表明，EHP、WSSV和DIV1為育苗場內的主要生物性危害因素，因此，這3種病原為凡納濱對蝦育苗場內構建生物安保體系的重點監(jiān)控病原。

由于苗種攜帶病原呈微量、隱性的感染特征，因此，其檢測方法首選樣品用量低、靈敏度高的分子生物學技術，如常規(guī)、套式和定量PCR等檢測技術。其中，定量PCR技術由于比普通PCR技術靈敏度更高且能夠確定病原感染程度，因此，越來越多地被應用于重要病原的檢測［13-14］。與此同時，為了適應大量樣品和多種病原的檢測需求，PCR檢測技術也在向高通量方向發(fā)展，比如多重和同步檢測技術［15-17］。然而，到目前為止還沒有見到同步檢測EHP、WSSV和DIV1的定量PCR技術的報道，因此，本研究的目標是建立同步檢測EHP、WSSV和DIV1的定量PCR技術，以期在提高病原檢測通量的同時，提高對種苗隱性感染病原的檢測靈敏度和對種苗風險評估的精確度，為苗場生物安保體系的構建和對蝦健康養(yǎng)殖提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 蝦和病原

EHP、WSSV和DIV1陽性對蝦樣品為本實驗室在上海、浙江等地養(yǎng)殖場采集的、經PCR分別鑒定的養(yǎng)殖對蝦，保存于-80℃冰箱；維氏氣單胞菌（A.veronii）、副溶血弧菌、哈維弧菌等病原為本實驗室保存；SPF蝦苗采自上海彰顯漁業(yè)合作社，為陰性對照樣品。

1.2 引物

分別設計靶向 DIV1 MCP基因（GenBank：MF599468）、EHP SWP 基 因 （GenBank：KX258197）和 WSSV 基 因 組 （GenBank：AF332093.3）的多對引物，送上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA提取

由于苗場蝦苗個體很小，可根據培育的不同時期采集一定數(shù)量的完整個體（約20 mg）勻漿，然后參考海洋動物基因組DNA提取試劑盒說明書（天根）提取樣品總DNA。

1.4 實時定量PCR質粒標準品的制備

以DIV1、EHP和WSSV陽性樣品的總DNA為模板，參考文獻［18］的方法和試劑，分別用合成的3種病原的定量PCR引物進行普通PCR擴增。擴增產物經凝膠電泳純化后連接pMDTM19-T載體，轉化感受態(tài)細胞DH5α。提取的陽性質粒DNA按10倍比稀釋成不同梯度的質粒標準品，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 同步擴增定量PCR反應體系和條件的確定及方法建立

首先，參考文獻［18］的方法和試劑，確定一種病原（DIV1）的SYBR Green I實時定量PCR擴增的最佳引物、反應體系和程序。然后，基于DIV1的反應體系和程序，用EHP和WSSV的系列候選引物對各自的質粒標準品進行定量擴增，根據檢測靈敏度、病原特異性和熔解曲線等篩選出各自的最佳擴增引物。最后，通過進一步驗證和優(yōu)化，建立基于SYBR Green I的3種病原同步定量PCR檢測技術。

2 結果與分析

2.1 同步擴增3種病原的實時定量PCR條件與體系的確定

首先，通過對DIV1引物的篩選，確定了其最佳擴增引物（表1）、反應體系和條件：擴增體系（20μL）包含 2×TB Green Premix ExTaqⅡ（Takara）10μL，引物 IVQF（10μM）0.6μL，引物 IVQR（10μM）0.6μL，DNA模板 2μL，無DNA酶水6.8μL。最后添加ROX Reference Dye 0.4μL；擴增條件為95℃ 30 s；然后，95℃ 5 s，60℃ 20 s，循環(huán)40次［19］。最后，將以上 DIV1定量PCR方法的體系和條件設定為3種病原同步定量PCR擴增的體系和條件。

2.2 同步擴增條件下，EHP和WSSV最優(yōu)實時定量PCR檢測方法的建立

為了達到同步、高效擴增3種病原的目的，基于 DIV1的擴增體系和條件，運用 EHP和WSSV的系列備選引物對各自的質粒標準品進行擴增。通過對各自方法的靈敏度、特異性以及穩(wěn)定性和熔解峰等篩選分析后，確定了 EHP和WSSV的最佳定量PCR引物（表1），建立了同步擴增條件下兩者的最優(yōu)定量PCR檢測方法。如圖1～圖2和表2～表3所示，兩種方法的相關系數(shù)（R2）均大于 0.99。其中，EHP的標曲方程和相關系數(shù)（R2）分別為y＝-3.381 5x+37.718和0.997，WSSV的標曲方程和相關系數(shù)（R2）分別為y＝-3.112 9x+35.626和0.999。

將以上系列標準品分別置于-80℃冰箱保存60 d后，各自重復檢測的結果差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 同步擴增DIV1、EHP和WSSV的實時定量PCR檢測技術的驗證

運用本研究建立的3種病原同步定量PCR檢測技術，對經套式PCR方法檢測過的15份樣品（部分樣品為1～3種病原陽性）進行同步擴增，并以無DNA酶水作對照，熔解曲線分析結果如圖3所示。在同一塊定量PCR板上，熔解曲線只在78.4℃、79.7℃、83.5℃處出現(xiàn)3個尖銳峰，分別與DIV1、EHP和WSSV定量擴增產物的Tm值一致，而陰性樣品和陰性對照沒有出現(xiàn)熔解峰。檢測結果如表4所示，15份樣品中包含8份DIV1陽性樣品、6份EHP陽性樣品和2份WSSV陽性樣品，檢出病原最低基因拷貝數(shù)分別為34 copy·μL-1（DIV1）、20 copy·μL-1（EHP）和 68 copy·μL-1（WSSV），而原先 nPCR的檢測陽性數(shù)分別為 6份（DIV1）、4份（EHP）和 1份（WSSV）。

表1 同步擴增DIV1、EHP和WSSV的定量PCR引物Tab.1 Primers for simultaneous detection of DIV1，EHP and WSSV

表2 EHP實時定量PCR技術的組內重復性Tab.2 Intragroup variabilities of SYBR GreenⅠ qPCR for EHP plasm id DNA dilutions

圖1 EHP SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測技術的建立Fig.1 Development of SYBR GreenⅠ-based qPCR assay for EHP

圖2 WSSV SYBR Green I實時定量PCR檢測技術的建立Fig.2 Development of SYBR GreenⅠ-based qPCR assay for WSSV

表3 WSSV實時定量PCR技術的組內重復性Tab.3 Intragroup variabilities of SYBR Green qPCR for WSSV p lasm id DNA dilutions

圖3 同步定量PCR檢測技術擴增對蝦DNA的產物熔解曲線圖Fig.3 M elting curves of products am p lified from shrim p DNA by synchronous SYBR G reen qPCR assay

表4 同步定量PCR和套式PCR對對蝦樣品中3種病原的檢測結果對比Tab.4 Comparison of detection results of three pathogens in L.vannamei sam p les by synchronous qPCR and nPCR assay

3 討論

白斑綜合征病毒、蝦肝腸胞蟲和蝦虹彩病毒自發(fā)生以來先后對我國養(yǎng)殖凡納濱對蝦造成了重大經濟損失［9，20-21］。研究表明，對蝦常常被兩種以上的病原同時感染，即對蝦病原存在共感染甚至協(xié)同致病現(xiàn)象。JOSEPH等［22］在斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）育苗場內調查發(fā)現(xiàn)，104份蝦苗樣品中，WSSV、斑節(jié)對蝦桿狀病毒（Penaeus monodonbaculovirus，MBV）和肝胰腺細小病毒（hepatopancreatic parvovirus，HPV）共感染（雙病原或3病原共感染）率占被檢蝦苗總數(shù)的60.6%；胡文娟等［23］對對蝦病毒的調查中也發(fā)現(xiàn)，WSSV與IHHNV在我國養(yǎng)殖的凡納濱對蝦中存在共感染現(xiàn)象。本研究中對蝦樣品的驗證結果也表明，當前養(yǎng)殖對蝦體內存在兩種病原（EHP與WSSV或EHP與DIV1）甚至3種病原（EHP、DIV1和WSSV）共感染的現(xiàn)象。多個研究表明，建立同步或多重定量PCR檢測技術可以讓對蝦病原的共感染現(xiàn)象和相對感染程度得到更清晰的揭示：SIBONGA等［24］通過建立多重PCR技術，發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對蝦育苗場內同時存在WSSV、MBV和IHHNV；劉飛等［25］則建立了可同時檢測6種對蝦病毒［WSSV、IHHNV、HPV、TSV、IMNV和對蝦桿狀病毒（BP）］的多重PCR檢測方法，大幅提高了病原檢測效率。但是，由于普通PCR方法需要對擴增產物進行電泳等后續(xù)處理，而且其檢測靈敏度比定量PCR要低很多，因此，多重或同步qPCR技術更加符合高通量、快速出報告的苗場生物安保監(jiān)測要求；而且，qPCR技術還可以對病原的感染程度進行準確評估。LEAL等［16］和XIE等［26］通過建立同時檢測WSSV、IHHNV的雙重qPCR技術和同時檢測 WSSV、IHHNV與TSV的三重（RT-）qPCR技術，不僅鑒別了對蝦樣品中共感染的病原，而且對每種病原的感染程度進行了定量分析。

由于寡核苷酸的添加會影響qPCR的擴增效率，因此，多重qPCR檢測靈敏度比單病原qPCR技術要低［16］。如果檢測對象為體質量較大的養(yǎng)殖對蝦，這種細小差異對于疾病診斷和病害防控策略的影響相對較小，但是對于體質量很輕且病原含量很低的蝦苗而言，采用同步qPCR檢測方法也許更為合適。本研究的質粒擴增結果表明，當總DNA中靶基因含量低至10 copy·μL-1時，本研究建立的3病原同步定量PCR檢測技術對每種病原均能保持良好的組內和組間重復性，其中，WSSV在基因拷貝數(shù)為1 copy·μL-1時仍然保持較好的組內和組間重復性。對經套式PCR鑒定過的對蝦樣品的驗證結果也顯示，15份樣品DNA中3種病原的最低基因含量分別為34 copy·μL-1（DIV1）、20 copy·μL-1（EHP）和 68 copy·μL-1（WSSV），這些病原的基因含量均低于nPCR對同一樣品的檢測限，因此，同步定量PCR檢測陽性數(shù)顯著多于nPCR。值得一提的是，本研究建立的WSSV定量PCR檢測技術，在WSSV含量為 2 copy·reaction-1（即 1 copy·μL-1）時對應的平均CT值仍然小于36，而已經報道的、同樣基于SYBR Green I染料法的WSSV定量PCR檢測方法，在WSSV基因含量為11.85 copy·reaction-1時，其CT值已經大于36［27］。以上分析表明，本研究所建立的同步定量PCR技術不僅穩(wěn)定，而且具有較高的檢測靈敏度。對熔解曲線進行分析還可以看出，在同一塊定量PCR板上對3種病原進行同步擴增后，擴增產物熔解曲線只在 78.4℃、79.7℃、83.5℃處出現(xiàn)3個尖銳峰，恰好對應DIV1、EHP和WSSV的產物Tm值，而陰性樣品和陰性對照均沒有出現(xiàn)熔解峰。事實上，該同步qPCR檢測技術已經多次被用于養(yǎng)殖凡納濱對蝦樣品的檢測，包括對部分養(yǎng)殖示范合作社內養(yǎng)殖蝦類病原的長期跟蹤檢測，并多次檢出了目的病原，其熔解曲線始終未見到異常擴增的情況（結果未顯示），表明此同步qPCR方法具有良好的病原特異性，在復雜樣品中只擴增目標病原基因序列［28］。除此之外，由于感染對蝦的微孢子蟲種類較多，因此，本研究選擇編碼EHP的SWP基因為靶標［29］，也在一定程度上提高了該同步定量PCR技術的病原特異性。

綜上，本研究建立的3種病原同步定量PCR檢測技術，可以充分發(fā)揮定量PCR技術96孔板、384孔板的高通量優(yōu)勢，尤其是當單份樣品中個體數(shù)量較少時，可實現(xiàn)多病原同板擴增，不僅能大幅縮短檢測時間，提高苗場病原監(jiān)測的時效性，而且可以快速揭示病原的共感染或協(xié)同現(xiàn)象。