不同配比復(fù)合益生菌對(duì)灰海馬幼苗存活、生長(zhǎng)及免疫的影響

蔡怡山，張 東，劉 鑫，林聽聽，夏連軍

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

灰海馬（Hippocampus erectus），又稱線紋海馬，我國(guó)于2009年從美洲引進(jìn)［1］，因其個(gè)體大、生長(zhǎng)快、養(yǎng)殖密度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)目前海馬養(yǎng)殖的主要品種。經(jīng)過(guò)近10年的養(yǎng)殖探索，灰海馬的人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)獲得了很大的突破［2-6］。近年來(lái)，我國(guó)沿海地區(qū)從南到北（如海南、廣東、福建、山東、河北等）不斷有灰海馬規(guī)模化養(yǎng)殖成功的報(bào)道。盡管灰海馬規(guī)模化養(yǎng)殖取得了可喜的成效，但和其他養(yǎng)殖海馬一樣［7］，灰海馬易患腸炎病，因而限制了灰海馬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

海馬主要使用價(jià)值在于藥用，為防止藥用成分受到污染或者藥用價(jià)值降低，用傳統(tǒng)抗菌藥物治療海馬腸炎病害并不適合，而且生產(chǎn)實(shí)踐也表明使用抗菌藥物的治療效果并不理想。在患病灰海馬和健康灰海馬腸道菌群的研究中發(fā)現(xiàn)，健康個(gè)體和患病個(gè)體腸道內(nèi)均含有大量的弧菌屬（Vibrio）細(xì)菌，但是健康個(gè)體還含有大量的乳桿菌屬（Lactobacillus）細(xì)菌，而患病個(gè)體極度缺乏乳桿菌屬細(xì)菌［8］。在庫(kù)達(dá)海馬（H.kuda）中也發(fā)現(xiàn)健康個(gè)體和患病個(gè)體腸道內(nèi)均含大量的弧菌屬細(xì)菌，但健康個(gè)體較患病個(gè)體含顯著豐富的芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌［9］。這兩項(xiàng)研究報(bào)道突顯了益生菌在維持海馬健康方面的作用。此外，借鑒益生菌在養(yǎng)殖魚類過(guò)程中發(fā)揮作用的成功案例［10-11］，推測(cè)益生菌可能對(duì)海馬腸炎具有預(yù)防甚至治療作用。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的益生菌有芽孢桿菌和乳酸菌（lactic acid bacteria）。其中，芽孢桿菌中最常用的有枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［12］和凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）［13］。乳酸菌種類繁多，按形狀可分桿菌和球菌，桿菌又分乳桿菌屬和雙岐桿菌屬（Bifidobacterium），球菌又分鏈球菌屬（Streptococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常用的乳酸菌有植物乳桿菌（L.plantarum）［14］、嗜酸乳酸菌（L.acidophilus）［15］和糞腸球菌（E.faecalis）［16-17］。這些益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中均取得了良好的效果。此外，已有不少研究表明，與單種益生菌相比，復(fù)合益生菌不僅集合了單種益生菌的功能，而且增加了協(xié)同共生作用，更適合復(fù)雜多變的生態(tài)環(huán)境［18］。SALINAS等［19-20］、ALY等［21］和夏磊等［22］分別研究發(fā)現(xiàn)，兩種或者3種益生菌聯(lián)合添加對(duì)各自養(yǎng)殖動(dòng)物（金頭鯛Sparus aurata、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus、凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei）的益生效果要明顯優(yōu)于單種菌。然而，復(fù)合菌以何種配比添加才能達(dá)到最優(yōu)效果，國(guó)內(nèi)外研究較少，這也制約了復(fù)合益生菌的應(yīng)用。另外，復(fù)合菌使用效果也因種而異［20-22］。為更好地研究益生菌對(duì)海馬養(yǎng)殖的有益效果，本研究以枯草芽孢桿菌以及乳酸菌中的植物乳桿菌和糞腸球菌為復(fù)合益生菌源，測(cè)試單菌及不同配比的復(fù)合益生菌對(duì)灰海馬幼苗養(yǎng)殖效果的影響，以期篩選出效果最佳的復(fù)合菌配比。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌粉

枯草芽孢桿菌購(gòu)自南京漁豐生物科技有限公司，植物乳桿菌和糞腸球菌購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣亞芯生物科技有限公司。三者均為白色或類白色粉末，使用前按產(chǎn)品說(shuō)明書的方法活化后，分別用乳酸菌常用培養(yǎng)基（MRS）和芽孢桿菌常用培養(yǎng)基檢測(cè)活菌量，得出活菌量均≥1×1011cfu·g-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)配比

本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的3種益生菌的配比及分組見表1。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書的參考使用量，本實(shí)驗(yàn)每組的菌粉添加濃度為15 mg·L-1，即往400 L的水體中加入總菌粉6 g。

表1 實(shí)驗(yàn)處理設(shè)計(jì)Tab.1 Experim ental design

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法

實(shí)驗(yàn)灰海馬2018年7—10月取自福建紳藍(lán)生物科技有限公司儲(chǔ)備的灰海馬優(yōu)質(zhì)親本同一天所產(chǎn)的新生苗［初始體高（1.0±0.1）cm］。本實(shí)驗(yàn)共分10組（表1），每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)在1個(gè)裝有400 L自然海水（水溫28～29℃、鹽度31～32）、持續(xù)充氣的玻璃缸養(yǎng)殖桶進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將新生苗隨機(jī)分配到各個(gè)養(yǎng)殖桶中，每桶200尾。將菌粉制備成懸濁液后，按所設(shè)定的配比向養(yǎng)殖桶中添加菌粉，即每桶6 g（濃度為15 mg·L-1）。之后每隔兩天添菌一次。添菌前，先將養(yǎng)殖桶中的水排去2／3，然后補(bǔ)加新鮮海水至400 L。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，除添菌當(dāng)天換水外，其他時(shí)間均不換水；幼苗每天投喂足量橈足類，上午和下午各一次。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)50 d。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 養(yǎng)殖水體菌群

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集各組的養(yǎng)殖水樣，分析水體中的弧菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌和乳酸菌。用硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基檢測(cè)弧菌總數(shù)，用 Man Rogosa Sharpe（MRS）培養(yǎng)基檢測(cè)乳酸菌總數(shù)，用芽孢桿菌常用培養(yǎng)基 （葡萄糖 10.0 g· L-1、磷酸鈣 5.0 g·L-1、硫酸銨 0.5 g·L-1、氯化鉀 0.2 g·L-1、七水硫酸鎂 0.1 g·L-1、硫酸錳 0.000 1 g·L-1、硫酸亞鐵 0.000 1 g·L-1、酵母提取物 0.5 g·L-1、瓊脂 20.0 g·L-1，pH 7.0±0.2）檢測(cè)芽孢桿菌總數(shù)。將水樣用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取1×10-1、1×10-2、1×10-33個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度100μL涂布于細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中弧菌和芽孢桿菌28℃培養(yǎng)24 h，乳酸菌37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)各培養(yǎng)基平板上的菌落數(shù)，數(shù)值以每毫升水含菌落數(shù)的對(duì)數(shù)（lg N）表示。

1.4.2 存活和生長(zhǎng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清點(diǎn)各個(gè)養(yǎng)殖桶存活的幼苗數(shù)量，計(jì)算存活率。之后，每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)取幼苗20尾，測(cè)量體長(zhǎng)，用于計(jì)算特定生長(zhǎng)率（SGR）。

SGR＝100×（lnLt-lnL0）／T（1）

式（1）中，Lt和L0分別表示實(shí)驗(yàn)結(jié)束后和開始前各組海馬的平均體長(zhǎng)，T表示實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

1.4.3 腸道免疫及菌群

體長(zhǎng)測(cè)量結(jié)束后，每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)取幼苗12尾，無(wú)菌解剖取其腸道。每4尾幼苗腸道置于1個(gè)DNAse／RNAse-Free凍存管，即每個(gè)養(yǎng)殖桶共有3個(gè)凍存管。所有凍存管于-80℃保存。

檢測(cè)時(shí)，其中1個(gè)凍存管用于分析幼苗腸道菌群，采用16S rDNA高通量測(cè)序分析技術(shù)，由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司協(xié)助完成。另外2個(gè)凍存管用于分析幼苗腸道免疫指標(biāo)。腸道組織化凍后，加入一定體積的預(yù)冷勻漿介質(zhì)（Tris-HCl 0.01 mol·L-1，EDTA-Na20.1 mol·L-1，蔗糖 0.01 mol· L-1，NaCl 0.13 mol· L-1，pH 7.4），冰浴勻漿后，離心（8 000 r·min-1，15 min，4℃）取上清液用于測(cè)定腸道組織蛋白（intestinal tract protein）、免疫球蛋白 Ig M、白介素 IL-1β、干擾素IFN-α和腫瘤壞死因子TNF-α的含量。檢測(cè)使用購(gòu)自南京建成生物工程研究所適合魚類檢測(cè)的試劑盒，并按其說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，存活率數(shù)據(jù)分析前經(jīng)反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)換。各組之間的差異顯著性用軟件Origin 8.0進(jìn)行單因素方差（One-way ANOVA）分析。若有顯著差異，則繼續(xù)進(jìn)行Tukey多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖水體菌群

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加菌處理組中，養(yǎng)殖水體均含有大量的目標(biāo)益生菌，確保了實(shí)驗(yàn)益生菌粉能在養(yǎng)殖水體中活化和存活（表2）。另外，加菌處理組中，養(yǎng)殖水體的弧菌含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 各組養(yǎng)殖水體中弧菌、芽孢桿菌和乳酸菌的數(shù)量Tab.2 Number of Vibrio spp.，Bacillus spp.and lactic acid bacteria in aquaculture water（lg N cfu·m L-1）

2.2 存活和生長(zhǎng)

不同益生菌配比對(duì)幼苗存活率影響顯著（One-way ANOVA，F(xiàn)9，29＝23.8，P＜0.05）。其中G組和I組的值最高，其均值均超過(guò)了65%；其次是A組、B組、C組和 H組，其均值為45% ～55%；以上6組均顯著高于對(duì)照組（≈40%）。存活率較低的是D組、E組和F組，其均值均低于35%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；另外，這3組的死亡個(gè)體絕大部分出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)38～45 d這個(gè)時(shí)間段（圖1）。特定生長(zhǎng)率除了B組和E組存在顯著差異外（P＜0.05），其他各組之間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；體高均由剛出生時(shí)的1 cm左右，經(jīng)過(guò) 50 d，生長(zhǎng)至（5.45±0.53）cm，其 SGR值為3.37±0.19（圖2）。

注：柱形圖上的不同小寫字母表示各組之間存在顯著差異（P＜0.05）Note：Different lowercase letters on the histogram indicate significant differences among treatments（P＜0.05）

圖2 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗特定生長(zhǎng)率Fig.2 Specific grow th rate of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

2.3 腸道免疫及菌群

不同益生菌配比對(duì)幼苗腸道Ig M含量有顯著影響 （One-way ANOVA，F(xiàn)9，29＝26.4，P＜0.05），呈現(xiàn)出與存活率近乎一致的變化趨勢(shì)，表現(xiàn)為存活率低的組別（如D組、E組和F組），其IgM含量就低；而存活率高的組別（A組、B組、C組、G組、H組和I組），對(duì)應(yīng)的Ig M含量就高（圖3）。而另 3個(gè)指標(biāo)（IL-1β，IFN-α和 TNF-α），不同配比間差異亦顯著（P＜0.05），但其變化趨勢(shì)則與存活率、Ig M截然相反，表現(xiàn)為存活率低的組別（如D組、E組和F組）反而含顯著高的IL-1β、IFN-α和 TNF-α；而剩余其他組則含量相對(duì)偏低，變化幅度較小，并且趨于穩(wěn)定水平（圖4～圖6）。

關(guān)于腸道菌群，各組之間變化較大。聚類分析結(jié)果表明，G組＆I組、A組＆B組＆C組、D組＆E組＆F組呈現(xiàn)出非常相近的菌群多樣性。相對(duì)豐度結(jié)果表明，在A組、B組、C組、G組、H組和I組這6組中，幼苗的腸道內(nèi)含豐富的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、植物乳桿菌和約氏乳桿菌（L.johnsonii）；而在 D組、E組和 F組則相對(duì)匱乏。另外，A組和G組含相對(duì)較高的強(qiáng)壯弧菌（V.fortis）（圖7）。

圖4 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗腸道IL-1β含量Fig.4 IL-1βcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

圖5 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗腸道IFN-α含量Fig.5 IFN-αcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different p roportions

圖6 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗腸道TNF-α含量Fig.6 TNF-αcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

3 討論

作為益生菌，不管源于何地，必須在養(yǎng)殖動(dòng)物腸道內(nèi)能夠定植，或者在養(yǎng)殖水體中能夠存活，甚至繁殖，這是探討益生菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物是否具有益生效果的先決條件［23］。鑒于目前市售的大部分益生菌，其菌源主要來(lái)源于陸生動(dòng)物腸道，可能不適應(yīng)海水環(huán)境或者水生動(dòng)物腸道，因此，非常有必要檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)益生菌粉是否能在海馬養(yǎng)殖水體中存活或者在海馬腸道中定植。本文的水體菌群數(shù)據(jù)和腸道菌群數(shù)據(jù)表明，添加了益生菌后，水體中和海馬腸道內(nèi)的益生菌含量顯著高于對(duì)照組，這個(gè)結(jié)果確保了實(shí)驗(yàn)益生菌粉能在養(yǎng)殖水體中存活和在腸道中定植的前提。正如其他研究中報(bào)道的一樣［24-25］，添加益生菌后，水體中的弧菌顯著降低，這可能歸因于益生菌成了優(yōu)勢(shì)菌群，從而在營(yíng)養(yǎng)和空間層面抑制了弧菌［11］。但與其他研究不同的是，本文發(fā)現(xiàn)益生菌組的海馬腸道內(nèi)的弧菌量沒有明顯抑制，反而部分明顯增加。而其他研究均一致表明添加了益生菌后，動(dòng)物腸道內(nèi)的弧菌量被明顯抑制［24-26］。這一截然不同的結(jié)果，可能歸因于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的餌料差異。其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以配合飼料為主，而海馬以活餌橈足類為主［1-2］。橈足類身上攜帶有大量的弧菌［27-28］，因此越健康、攝食越旺盛的海馬其腸道內(nèi)含橈足類就越多，相應(yīng)地弧菌含量就高。在先前的研究中，筆者也嘗試通過(guò)抗菌藥物前處理橈足類以降低其弧菌攜帶量，進(jìn)而投喂海馬來(lái)預(yù)防腸炎，結(jié)果顯示，短期內(nèi)投喂消毒后的橈足類，海馬的生長(zhǎng)存活表現(xiàn)明顯改善，但長(zhǎng)期投喂易導(dǎo)致病害頻發(fā)，甚至較投喂未消毒橈足類的海馬更甚［28］。通過(guò)腸道菌群分析，筆者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期投喂消毒后的橈足類致使海馬腸道菌群發(fā)生很大變化，弧菌豐度雖顯著降低，但其他菌，特別是益生菌，亦顯著降低，菌群多樣性降低［28］。所以，海馬腸道內(nèi)弧菌低，益生菌也低，則易發(fā)??；而弧菌高，益生菌也高，則不易發(fā)病，這一對(duì)比突顯了益生菌在維持海馬健康方面的作用。

圖7 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后各處理組幼苗腸道內(nèi)菌群的分析結(jié)果（16S rDNA高通量測(cè)序）Fig.7 Intestinalm icrobiota of Hippocampus erectus juveniles at each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions（analysed by 16S rDNA sequencing analysis）

除了能抑制弧菌外，益生菌還可以提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，起到預(yù)防疾病的效果［8，18-22］。本文的存活率數(shù)據(jù)和腸道免疫指標(biāo)數(shù)據(jù)也驗(yàn)證了這一效果。Ig M、IL-1β、IFN-α和 TNF-α是機(jī)體非常重要的、與發(fā)病過(guò)程息息相關(guān)的免疫指標(biāo)。Ig M通常作為抗病力的指示指標(biāo)，高值往往代表著高的抗病能力；而 IL-1β、IFN-α和TNF-α通常作為炎癥的指示指標(biāo)，高值往往代表著發(fā)炎或者感染的狀態(tài)［29-31］。本文結(jié)果顯示，高存活率的組別，其Ig M含量也高，這正驗(yàn)證了高Ig M代表高抗病能力的觀點(diǎn)。而低存活率的組別，Ig M含量低，但 IL-1β、IFN-α和 TNF-α含量高，這也正說(shuō)明了低存活率組別的幼苗抗病力低，正處于炎癥狀態(tài)。作為炎癥狀態(tài)的證據(jù)是：低存活率組別的幼苗死亡時(shí)間段集中在35～45 d，而指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（50 d）恰位于這個(gè)時(shí)間段附近。除了提高免疫力、增加抗病力的作用外，益生菌還有一個(gè)比較公認(rèn)的作用是促生長(zhǎng)［11］；而本文未見促生長(zhǎng)作用，其原因可能跟海馬的攝食特點(diǎn)有關(guān)。海馬貪食，即使處于非健康狀態(tài)、甚至患病狀態(tài)，仍然大量進(jìn)食。死亡的腸炎海馬中少見個(gè)體瘦癟的海馬，常見個(gè)體粗壯的海馬。從存活率數(shù)據(jù)和腸道免疫數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌均能獨(dú)自改善灰海馬幼苗的養(yǎng)殖效果，但若將這3者混合起來(lái)使用，效果各異。復(fù)合菌有優(yōu)于單菌的，如按2∶3∶1或3∶2∶1比例混合，但也有不及單菌的，如按 1∶2∶3、1∶3∶2或 2∶1∶3比例混合。這一結(jié)果表明，復(fù)合菌要想取得優(yōu)于單菌的益生效果，單菌之間的配比至關(guān)重要。配比失衡，效果反而不及單菌。SALINAS等［19］研究表明，枯草芽孢桿菌和德氏乳桿菌乳酸亞種（L.delbrueckiisubsp lactis）聯(lián)合添加對(duì)金頭鯛的免疫提升效果要優(yōu)于單菌添加。潘雷等［32］研究也表明，枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和異形雙歧桿菌（B.inopinatum）聯(lián)合添加對(duì)大菱鲆（Scophthalmusmaximus）的腸道弧菌抑制效果要優(yōu)于單菌添加。以上兩篇報(bào)道所設(shè)定的混合比例只有1∶1一組。在多配比報(bào)道中，夏磊等［22］比較了鮑魚希瓦氏菌（Shewanell haliotis）、蠟樣芽孢桿菌和雙殼氣單胞菌（Aeromonas bivalvium）這3個(gè)益生菌9種復(fù)合比例對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫及抗氨氮的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各比例效果各異，其中6∶1∶3促生長(zhǎng)效果最好，4∶3∶1抗氨氮效果最佳。類似地，王姝等［33］則比較了沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudpmonas palustris）和枯草芽孢桿菌4種復(fù)合比例對(duì)池塘水質(zhì)的改善效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4∶1的比例最好。

從本文9個(gè)配比中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌按2∶3∶1或3∶2∶1比例配搭時(shí)，效果最佳。從這兩個(gè)配比中可以推出，復(fù)合菌的益生效果可能是枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌起著主導(dǎo)作用，而糞腸球菌起輔助作用。糞腸球菌的比例一高，可能會(huì)抑制枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌，或者產(chǎn)生拮抗作用。菌菌之間相互競(jìng)爭(zhēng)而彼此不能繁殖；或者某菌繁殖，而另兩菌死亡敗壞，從而導(dǎo)致水體耗氧、亞氮增加，進(jìn)而危及養(yǎng)殖動(dòng)物［19］。