擬穴青蟹一種含CTLD結(jié)構(gòu)域基因的克隆及表達(dá)分析

王 田，趙 明，張鳳英，馬凌波，馬春艷

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）隸屬于甲殼綱（Crustacea），梭子蟹科（Portunidae），青蟹屬，是我國重要的海水養(yǎng)殖蟹類，主要分布在東南沿海［1］。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖水域的水質(zhì)逐漸惡化，導(dǎo)致病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。提高擬穴青蟹自身免疫力能減少抗生素的使用，對于蟹苗成活率的提高及良性養(yǎng)殖模式的建立具有重要意義。擬穴青蟹的血液循環(huán)方式為開管式循環(huán)，因而缺乏抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，僅具有先天性免疫［2-3］。模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）能夠與病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）結(jié)合，二者的相互識別和作用是啟動先天免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。C型凝集素（C-type lectin，CLEC）是鈣離子依賴型的一類動物凝集素［4］，是擬穴青蟹重要的模式識別受體［4-5］，種類繁多，功能多樣，是免疫研究的一大熱點(diǎn)。

C型凝集素的典型特點(diǎn)是具有一個或多個糖識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD），CRD必須與鈣離子結(jié)合才能發(fā)揮凝集活性［4］。研究證實(shí)C型凝集素家族中的一些蛋白已失去凝集活性，因而將CRD改為CTLD（C-type lectin-like domain）更為準(zhǔn)確。CTLD是C型凝集素家族的功能保守區(qū)，含有110～130個氨基酸殘基，其整體為內(nèi)外雙環(huán)結(jié)構(gòu)，內(nèi)環(huán)也叫長環(huán)區(qū)（long loop region，LLR），長環(huán)區(qū)參與了鈣離子依賴的糖結(jié)合活性，能夠識別PAMP，從而激發(fā)先天免疫反應(yīng)。根據(jù)有無長環(huán)區(qū)將CTLD分為常規(guī)型和緊密型兩種類型。除此之外，CTLD含有4個保守的半胱氨酸，可形成兩對二硫鍵，以此來穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)。與脊椎動物C型凝集素的保守性相比［6］，無脊椎動物含有種類更為豐富、功能更加多樣的 C型凝集素，例如，在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的基因組中檢測到32個編碼 CTLD的基因，在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)了至少183個 C型凝集素基因［7］，這表明無脊椎動物的C型凝集素極有可能具有不同的配體特異性。目前對于擬穴青蟹C型凝集素的研究有了較為豐富的成果，例如已證明C型凝集素表達(dá)于多種重要的免疫組織［8-9］，如肝胰腺、血淋巴、鰓等。且同一組織可產(chǎn)生多種不同功能的C型凝集素［8-9］。這些凝集素參與前酚氧化酶活化［10］、包膜增強(qiáng)［10］、血細(xì)胞結(jié)瘤、抗菌活性［11］、抗真菌活性［12］等，例如，來自煙草天蛾（Manduca sexta）幼蟲的C型凝集素可刺激酚氧化酶活化或促進(jìn)細(xì)胞包囊和黑化［13］。由于C型凝集素種類及功能多樣，擬穴青蟹中C型凝集素的分子特征和功能還有很大的研究空間。

本文在擬穴青蟹中發(fā)現(xiàn)了一種含CTLD結(jié)構(gòu)域的新基因，將其命名為SpCTLD，通過生物信息學(xué)方法對其cDNA全長進(jìn)行分析，通過qPCR技術(shù)檢測該基因在擬穴青蟹幼體不同發(fā)育時(shí)期和組織中的表達(dá)，通過人工感染副溶血弧菌來初步研究SpCTLD在擬穴青蟹抗細(xì)菌反應(yīng)中是否發(fā)揮作用，旨在豐富擬穴青蟹C型凝集素的研究，對其先天免疫機(jī)制的研究起到參考作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬穴青蟹幼體樣本取自海南瓊海東海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地，根據(jù)擬穴青蟹不同發(fā)育時(shí)期的特點(diǎn)，可將其幼體時(shí)期分為溞狀幼體 I-V（Z1-Z5）、大眼幼體（M）、仔蟹 I期（C1）和仔蟹Ⅱ期（C2）。未處理的成蟹樣本購于上海市東方水產(chǎn)市場。副溶血弧菌脅迫實(shí)驗(yàn)所用成蟹樣本網(wǎng)購于潮汕，經(jīng)形態(tài)及分子鑒定，確定為擬穴青蟹。實(shí)驗(yàn)前將擬穴青蟹在本實(shí)驗(yàn)室水循環(huán)系統(tǒng)中提前養(yǎng)殖一周。所取樣品均加無液氮型樣品RNA保存液（生工生物工程有限公司），凍至-80℃保存，以備后續(xù)提取RNA使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SpCTLD全長的獲得

本實(shí)驗(yàn)室通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得了SpCTLD的核心序列，在此基礎(chǔ)上利用 NCBI在線軟件（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primerblast／）設(shè)計(jì)特異性引物，5′-RACE的特異性引物為 5-F1：TTGCTTTCTCTGACCCTTAT，3′-RACE的特 異 性 引 物 為 3-R1：TCTAAGCCAACGAATGCAGC，另一方向引物為試劑盒自帶通用引物。將RACE產(chǎn)物電泳檢測，并割膠回收目的條帶，克隆到 pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆送至上海杰李生物公司測序，通過對所得序列進(jìn)行拼接，并與本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫進(jìn)行本地Blast，最終獲得1 237 bp的 cDNA序列（Genebank：MN508365）。3′-RACE結(jié)果見圖1。

圖1 3′-RACE擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification result of 3′-RACE

1.2.2 序列的生物信息學(xué)分析

使用 NCBI在線比對工具 BLAST（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進(jìn)行比對分析。使用 ORF Finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）查找序列的開放閱讀框。使用 InterPro（http：／／www.ebi.ac.uk／interpro／）分析蛋白質(zhì)的同源家族、保守結(jié)構(gòu)域、信號肽等。使 用 ExPASy （https：／／web. expasy. org／protparam／）分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。使用 Target P 1.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）預(yù)測亞細(xì)胞定位，使用 Mitoprot（http：／／ihg.gsf.de／ihg／mitoprot.html）預(yù)測線粒體定位序列。

1.2.3 病原脅迫實(shí)驗(yàn)的樣品處理

實(shí)驗(yàn)所用擬穴青蟹平均體質(zhì)量在80 g左右，設(shè)置4組樣本，分別為空白對照組、生理鹽水組、滅活的副溶血弧菌組、有活性的副溶血弧菌組。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)證明1×105CFU·mL-1是擬穴青蟹產(chǎn)生免疫響應(yīng)的最佳劑量。將培養(yǎng)的副溶血弧菌稀釋為1×105CFU·mL-1，取二分之一體積進(jìn)行高溫高壓滅活?？瞻讓φ战M不注射任何藥品，其他3組分別注射生理鹽水、滅活的副溶血弧菌、有活性的副溶血弧菌，每只擬穴青蟹注射量為 25μL?？瞻讓φ战M取樣時(shí)間為 0、3、6、9、12、24 h，其他 3組取樣時(shí)間點(diǎn)為 3、6、9、12、24 h，每組每個取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個重復(fù)（3只蟹），所取組織為血淋巴（HE）、肝胰腺（HEP）、胸神經(jīng)節(jié)（TG）、肌肉（MU）、鰓（GI）、心臟（H）、大觸角（ATA）、小觸角（ATU）、Y器（YO）、表皮（CU）、眼柄（ET），組織樣品加無液氮型樣品RNA保存液（生工生物工程有限公司），凍至-80℃保存，后續(xù)提取RNA并反轉(zhuǎn)錄。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析

由于18S rRNA在擬穴青蟹的多種樣本中穩(wěn)定表達(dá)，本文將其作為SpCTLD基因表達(dá)分析的內(nèi) 參 基 因［14］，18S 引 物 序 列 為 18S-F：GGGGTTTGCAATTGTCTCCC，18S-R：GGTGTGTA CAAAGGGCAGGG。每個樣本3個重復(fù)，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析SpCTLD在各個樣本中的相對表達(dá)量，并對其進(jìn)行生物學(xué)顯著性差異分析。qPCR所用引物為 C-F：TCTGACCCTTATCGCGGCTA，CR：AAAAAGGAGGTCAGCCCCTC。所用試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司的Tip Green qPCR SuperMix試劑盒，反應(yīng)體系為10μL，包含正向引物0.2μL，反向引物0.2μL，SuperMix 5μL，無核酸酶水3.6μL，cDNA模板1μL，兩步法程序設(shè)為94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpCTLD基因的cDNA序列分析

通過序列擴(kuò)增，獲得的SpCTLD基因cDNA全長為1 237 bp，其中開放閱讀框?yàn)?68 bp，編碼155個氨基酸，此外還有82 bp的5′UTR和687 bp的3′UTR，在3′UTR區(qū)域含有典型的加尾信號AATAAA（圖 2）。預(yù)測其蛋白分子量為18.32 kDa，等電點(diǎn)為 7.56。Target P 1.1 Server和Mitoprot預(yù)測該蛋白定位于線粒體，含有信號肽，為分泌蛋白，該預(yù)測可靠性等級為1（最高等級可信度）。線粒體靶向序列為第1到14個氨基酸（MAPSRPLVLLTVLL），切割位點(diǎn)為第15個氨基酸（S）。信號肽預(yù)測結(jié)果為第1到21個氨基酸，信號肽N端為第1到6個氨基酸，疏水核心區(qū)為第7到16個氨基酸，C端為第17到21個氨基酸。配體結(jié)合位點(diǎn)為124E、128A、130N、136K、138S、139S、140E、141Y、144D、145Y、146K。結(jié)構(gòu)域CTLD位于第26到151個氨基酸。在第89到91個氨基酸出現(xiàn)了Ca2+特征性識別基序LND。

2.2 SpCTLD基因在擬穴青蟹幼體和組織中的表達(dá)

從溞狀幼體I期到仔蟹Ⅱ期，SpCTLD在擬穴青蟹幼體各個時(shí)期均有表達(dá)（圖3），并且整體表達(dá)量較高。從Z1期到Z4期整體表達(dá)量較為穩(wěn)定，至Z5期達(dá)到最高點(diǎn)，而后至M期和C1期略有下降，C2期表達(dá)量大幅下降，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他時(shí)期，達(dá)到最低點(diǎn)。

qPCR檢測SpCTLD在擬穴青蟹不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，SpCTLD在所檢測的12個組織（血淋巴HE、肝胰腺HEP、眼柄ET、射精管ETU、精巢 TE、肌肉 MU、鰓GI、心臟 H、大觸角ATA、小觸角ATU、Y器 YO、表皮 CU）中均有表達(dá)（圖4），其中在鰓中表達(dá)量最高，射精管次之，且兩者的mRNA表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織。SpCTLD在肝胰腺、表皮、大觸角、小觸角、血淋巴、肌肉這幾個組織中的表達(dá)量比較接近，遠(yuǎn)低于其在鰓和射精管的表達(dá)量。其中心臟、Y器、眼柄以及精巢的mRNA呈現(xiàn)顯著低表達(dá)，且這幾者的表達(dá)量較為接近。

2.3 病原脅迫樣本中SpCTLD基因的表達(dá)分析

副溶血弧菌感染擬穴青蟹后，選取肝胰腺、血淋巴、鰓3個重要的免疫組織進(jìn)行SpCTLD表達(dá)模式分析，SpCTLD的mRNA在組織中的相對表達(dá)量變化分別對應(yīng)圖5、圖6、圖7。綜合來看，3個組織中的空白對照組和生理鹽水組表達(dá)較為平穩(wěn)，整體變化不大。在肝胰腺中，活菌組中SpCTLD的表達(dá)在9 h明顯升高，到12 h達(dá)到最高。滅活菌組和活菌組的表達(dá)模式基本一致，但滅活菌組的表達(dá)量明顯低于活菌組。在血淋巴中，滅活菌組在9 h表達(dá)量達(dá)到最高，活菌組在12 h達(dá)到最高。在鰓中，滅活菌組的mRAN表達(dá)量變化不顯著，活菌組的表達(dá)量在12 h達(dá)到最高。

圖2 SpCTLD的cDNA全長及編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and coding am ino acids of SpCTLD

圖3 SpCTLD基因在幼體不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig.3 Expression of SpCTLD during different larval development stages

圖4 SpCTLD在不同組織中的表達(dá)Fig.4 Tissue distribution analysis of SpCTLD

圖5 不同處理組樣本肝胰腺中SpCTLD的表達(dá)變化Fig.5 Expression of SpCTLD in hepatopancreas sam ples from different treatment groups

圖7 不同處理組樣本鰓中SpCTLD的表達(dá)變化Fig.7 Exp ression of SpCTLD in gill sam p les from different treatment groups

3 討論

本研究獲得了擬穴青蟹一種C型凝集素新基因SpCTLD的cDNA全長，生物信息分析顯示，SpCTLD具有C型凝集素家族的保守結(jié)構(gòu)域CTLD（26-151aa），此結(jié)構(gòu)主要由兩個α螺旋和兩個反向的β折疊組成［15］，其雙環(huán)結(jié)構(gòu)中的長環(huán)區(qū)參與了鈣離子依賴的糖結(jié)合活性，能夠通過識別PAMP從而激發(fā)先天免疫反應(yīng)。CTLD超家族內(nèi)部存在廣泛的結(jié)構(gòu)差異，具有除糖結(jié)合外的一系列其他功能。CTLD含有的Ca2+特征性識別基序有 EPN，N-乙酰氨基葡萄糖胺（GlcNAc），巖藻糖（Fuc）和葡萄糖（Glc），QPD（Gln-Pro-Asp）等，能夠識別半乳糖（Gal）和 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）［16］。其中EPN基序?qū)Ω事短堑慕Y(jié)合起重要作用，QPD基序?qū)Π肴樘堑慕Y(jié)合起重要作用。所有的脊椎動物都有一個WND基序。但在無脊椎動物中，進(jìn)化導(dǎo)致了CTLD缺乏特征性基序WND，或者突變?yōu)槠渌愃苹?。例如在LvLT［17］和 PsLT［11］中，WND基序被 VND取代。同樣，MnCTLDcp1中的 WND被 WTD替代［18］。有研究表明，許多蝦的QPD基序發(fā)生了突變。昆蟲和蝦的 C型凝集素或含有 FRD，或含有VND［19］，但這并不影響它們的細(xì)菌凝集活性或特異性［20］。本研究獲得的擬穴青蟹SpCTLD氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)WND基序，而是存在LND基序，而LND是Ca2+特征性識別基序之一，因此符合無脊椎動物CTLD的進(jìn)化特征。

一般來說，基因功能和其表達(dá)分布存在密切關(guān)系。SpCTLD在擬穴青蟹幼體不同時(shí)期都有表達(dá)且整體表達(dá)量較高，在溞狀幼體Ⅴ期表達(dá)量最高，推測與溞狀幼體Ⅴ期向大眼幼體變態(tài)有關(guān)，因?yàn)樽儜B(tài)過程中青蟹抵抗力弱，易受病菌感染。仔蟹Ⅱ期表達(dá)量最低，可能是由于隨著青蟹的發(fā)育，其生理機(jī)能趨于完善，適應(yīng)能力與生存能力大幅提升。對SpCTLD的組織分布分析表明，在所檢測的12個組織中均有表達(dá)，即SpCTLD傾向于廣泛分布，這與先前的一些研究結(jié)果一致——在除了肝胰腺的其他組織中高表達(dá)的C型凝集素傾向于廣泛分布［15］。甲殼動物的鰓是一種非常重要的器官，具有呼吸、排泄、滲透壓調(diào)節(jié)、病害防御等功能［21］。本研究中SpCTLD在鰓中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織，符合鰓的生物學(xué)功能特征。另外，SpCTLD在射精管中的顯著高表達(dá)值得注意，提示該基因可能與青蟹的生殖相關(guān)。這與先前的研究有相似之處，段利朋等［22］從擬穴青蟹肝胰腺中克隆得到兩條C型凝集素基因：Splectin3和Sp-lectin4，二者于射精管中高表達(dá)，證明其在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，因此SpCTLD在擬穴青蟹生殖系統(tǒng)中的具體功能需要深入研究。副溶血弧菌脅迫實(shí)驗(yàn)中，活菌組都在12 h達(dá)到最高，在24 h迅速下降，滅活菌組在9 h或12 h達(dá)到最高，樣本處理后12 h內(nèi)活菌組SpCTLD的mRNA表達(dá)量上調(diào)最為顯著，說明SpCTLD可能參與了擬穴青蟹的抗副溶血弧菌反應(yīng)，但對于闡明SpCTLD的具體作用機(jī)制及功能，后期還需深入研究。

綜上，本研究獲得了擬穴青蟹C型凝集素家族新基因SpCTLD的cDNA全長，通過副溶血弧菌脅迫實(shí)驗(yàn)初步證明了其參與擬穴青蟹抗細(xì)菌反應(yīng)，在擬穴青蟹先天免疫過程中發(fā)揮作用，該研究結(jié)果對豐富C型凝集素在甲殼動物先天免疫反應(yīng)中的研究有積極意義。