大口黑鱸北方亞種群體和“優(yōu)鱸1號(hào)”群體及其正反雜交子代的遺傳和生長(zhǎng)性能比較

周家輝，李勝杰，姜 鵬，孫 雪，韓林強(qiáng)，白俊杰

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)，上海 201306；3.佛山市三水白金水產(chǎn)種苗有限公司，廣東佛山 528133）

大口黑鱸（Micropterus salmoides），隸屬于鱸形目（Perciformes），太陽(yáng)魚(yú)科（Cehtrachidae），黑鱸屬，是一種著名的游釣性魚(yú)類(lèi)，根據(jù)形態(tài)和地理分布差異大口黑鱸可分為北方亞種（M.salmoides salmoides）和佛羅里達(dá)亞種（M.salmoides floridanus）［1］。大口黑鱸具有生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)、起捕率高、無(wú)肌間刺、肉質(zhì)鮮美等諸多優(yōu)點(diǎn)［2］，深受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者喜愛(ài)，現(xiàn)已推廣到全國(guó)各地養(yǎng)殖。2017年大口黑鱸國(guó)內(nèi)年產(chǎn)量為45.7萬(wàn) t［3］，是我國(guó)的主導(dǎo)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一。樊佳佳等［4］和李勝杰等［5］通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和分子標(biāo)記的研究表明，我國(guó)養(yǎng)殖的大口黑鱸在分類(lèi)地位上屬于北方亞種?；谌后w選育，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所培育的大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”（GS01-004-2010）新品種生產(chǎn)性能優(yōu)良，其推廣應(yīng)用在一定程度上滿(mǎn)足了養(yǎng)殖業(yè)的需求，但目前苗種市場(chǎng)對(duì)良種的需求仍然較大［6-7］。

大口黑鱸自1983年從中國(guó)臺(tái)灣引進(jìn)到內(nèi)地后，未再引進(jìn)新的種質(zhì)資源。經(jīng)過(guò)多年的養(yǎng)殖，國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的大口黑鱸群體的遺傳多樣性顯著低于國(guó)外的野生群體［8］。因此本實(shí)驗(yàn)室于2010年重新從美國(guó)引進(jìn)大口黑鱸北方亞種野生群體，其遺傳多樣性較為豐富，遺傳改良潛力較大。雜交育種是獲得具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的養(yǎng)殖品種的有效途徑之一，能夠?qū)⒂H本的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移給子代［9］。本研究將大口黑鱸北方亞種引進(jìn)群體和大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”進(jìn)行自交和正反雜交，分析自交與正反交子代間的遺傳多樣性以及篩選生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的組合，以期為大口黑鱸優(yōu)良品種的培育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

繁殖用的大口黑鱸“優(yōu)鱸1號(hào)”和北方亞種引進(jìn)群體親魚(yú)均來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所良種基地，北方亞種引進(jìn)群體為2010年從美國(guó)引進(jìn)的野生群體的第3代子代。2017年3月從兩個(gè)群體中分別挑選無(wú)病無(wú)傷、平均體質(zhì)量為0.65 kg的1齡魚(yú)作為親魚(yú)，注射LRH-A2和DOM進(jìn)行人工催產(chǎn)。每組繁殖所用親本數(shù)量均為80尾，雌雄比率1∶1，在水泥池中自然產(chǎn)卵受精，孵化出來(lái)的魚(yú)苗按照常規(guī)育苗方法進(jìn)行培育［6］。為方便闡述，北方亞種自交群體、“優(yōu)鱸1號(hào)”自交群體、正交群體［北方亞種（♀）ד優(yōu)鱸1號(hào)”（♂）］、反交群體［“優(yōu)鱸1號(hào)”（♀）×北方亞種（♂）］分別用N、G、NG和GN表示。生長(zhǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)群體挑選30尾剪取部分鰭條固定于95%的乙醇中備用。

1.2 微衛(wèi)星引物

實(shí)驗(yàn)所用的12對(duì)大口黑鱸SSR引物（表1）參考梁素嫻等［10］所篩選，具有較高的遺傳多態(tài)性。所有引物均由廣東艾基生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取鰭條樣品基因組DNA。提取的基因組DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，利用紫外分光光度計(jì)（Eppendorf公司AG2231型）檢測(cè)濃度，用ddH2O稀釋至50 ng·μL-1，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR反應(yīng)條件及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，分別包含：10 μL 2×MasterMix（Bioteke公司）、上下游引物（10 μmol·L-1）各 2μL、模板 DNA 1μL、ddH2O 5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s，退火45s，72℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10 min，4℃保存。產(chǎn)物檢測(cè)委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分型分析，具體方法為：將PCR產(chǎn)物與特異性熒光標(biāo)記（FAM、HEX或ROX）混勻，后置于ABI3730XL測(cè)序儀（美國(guó) ABI公司）樣本架上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，數(shù)據(jù)采集，分析每個(gè)SSR引物在不同樣本中的條帶數(shù)確定各樣本基因型。

1.3.3 生長(zhǎng)比較

為了比較自交與正反交子代在生長(zhǎng)速度上的差異，在珠江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地的水泥池中進(jìn)行生長(zhǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)。待魚(yú)苗生長(zhǎng)到體質(zhì)量30 g左右時(shí)，從各個(gè)組中各挑選60尾規(guī)格接近的實(shí)驗(yàn)魚(yú)，采用CWT對(duì)不同部位進(jìn)行標(biāo)記后同塘養(yǎng)殖，N、G、NG和GN群體注射位置順序依次為臀部、腹部、背部和頭部。實(shí)驗(yàn)起止時(shí)間為3月齡至12月齡（2017年8月至2018年5月），期間5、8月齡和12月齡各測(cè)量一次數(shù)據(jù)，每組測(cè)量至少30尾魚(yú)。測(cè)量方法：使用電子天平稱(chēng)量體質(zhì)量、數(shù)碼相機(jī)拍照記錄魚(yú)苗生長(zhǎng)狀態(tài)、魚(yú)類(lèi)外部形態(tài)測(cè)量軟件測(cè)量魚(yú)體形態(tài)指標(biāo)。

表2 4個(gè)大口黑鱸群體在12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中的遺傳多樣性信息Tab.2 Genetic diversity information of 4 M icropterus salmoides populations based on 12 m icrosatellite loci

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)每個(gè)個(gè)體PCR擴(kuò)增條帶的大小確定其基因型，運(yùn)用 Popgene32（Version 1.31）軟件分析各群體中每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、遺傳分化指數(shù)F-統(tǒng)計(jì)量（Fst）以及 Nei’s遺傳距離（Ds）?；诘任换蝾l率，運(yùn)用PICCALC軟件計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）。采用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析比較檢驗(yàn)組間差異，以P＜0.05作為差異顯著。

生長(zhǎng)數(shù)據(jù)分析所用公式為：

絕對(duì)增長(zhǎng)率 （AGR）＝（W2-W1）／（d2-d1）

特定增長(zhǎng)率 （SGR）＝100×（lnW2-lnW1）／（d2-d1）

式中，W1、W2分別為實(shí)驗(yàn)天數(shù)d1和d2時(shí)實(shí)驗(yàn)魚(yú)的體質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)不同群體的遺傳多樣性分析

12對(duì)SSR引物在N、G、NG和GN 4個(gè)群體所有個(gè)體中均能擴(kuò)增出清晰的條帶，共擴(kuò)增出126個(gè)等位基因（表2）。除JZL60位點(diǎn)在G群體中表現(xiàn)為單態(tài)外，其他位點(diǎn)在大口黑鱸4個(gè)群體中均表現(xiàn)出多態(tài)性。N、G、NG和GN群體的平均等位基因數(shù)（Na）分別為 2.6、2.4、2.7和 2.8，平均有效等位基因數(shù)（Ne）分別為 2.1、2.0、2.3和2.1，平均觀測(cè)雜合度（Ho）分別為 0.519、0.480、0.729和 0.664，平均期望雜合度（He）分別為0.419、0.454、0.553和 0.519，平均多態(tài)信息含量（PIC）分別為 0.407、0.412、0.454和 0.425。4個(gè)群體中，NG群體的平均有效等位數(shù)、平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量均為最高，其遺傳多樣性最高，而G群體的遺傳多樣性最低。

2.2 不同群體間遺傳分化和親緣關(guān)系

大口黑鱸4個(gè)群體間的Fst統(tǒng)計(jì)量見(jiàn)表3，根據(jù)WRIGHT［13］提出的遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)，GN群體與G群體的遺傳分化指數(shù)最大（0.149），達(dá)到中等分化；N群體與G群體的遺傳分化指數(shù)最?。?.019），分化很弱。4個(gè)群體的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離見(jiàn)表3，根據(jù)Nei’s計(jì)算群體的遺傳距離，N群體和G群體之間的遺傳距離最近（0.034），GN群體和G群體間的遺傳距離最遠(yuǎn)（0.384）。將不同群體間的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)（圖1），結(jié)果顯示，N群體和G群體首先聚為一支，然后再與NG群體聚為一支，最后與GN群體聚合。

2.3 不同群體間的生長(zhǎng)速度比較

各取樣月齡內(nèi)，4個(gè)群體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。對(duì)不同群體間的各生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。12月齡時(shí) N、G、NG、GN群體的平均體質(zhì)量分別為（388.22±72.08）、（372.50±83.51）、（400.12±89.36）、（419.91±66.82）g。在體質(zhì)量和體高平均值方面，4個(gè)群體從大到小排序依次均為GN＞NG＞N＞G。生長(zhǎng)速度比較見(jiàn)表5，4個(gè)群體的體質(zhì)量日增長(zhǎng)量隨著月齡的增加呈現(xiàn)先升高后降低，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間AGR和SGR從大到小排列次序分別為GN＞NG＞N＞G和GN＞NG＞G＞N，結(jié)果顯示在生長(zhǎng)速度方面GN群體最快，其次為NG群體。

表3 大口黑鱸4個(gè)群體的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)Tab.3 Nei’s genetic distance and pairw ise F st among four M icropterus salmoides populations

圖1 大口黑鱸北方亞種引進(jìn)群體、“優(yōu)鱸1號(hào)”及其雜交子代的UPGMA聚類(lèi)分析圖Fig.1 UPGMA clustering using Nei’s unbiased genetic distance（1978）of four M icropterus salmoides populations

表4 各采樣月齡內(nèi)大口黑鱸4個(gè)群體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)和體高的比較Tab.4 Comparation of grow th of body weight，body length and body height of four M icropterus salmoides populations

表5 各采樣月齡內(nèi)大口黑鱸4個(gè)群體的體質(zhì)量增長(zhǎng)率Tab.5 Grow th rate of body weight of four M icropterus salmoides populations at different periods

3 討論

3.1 4個(gè)大口黑鱸群體的遺傳多樣性及遺傳分化

微衛(wèi)星DNA又稱(chēng)為短串聯(lián)重復(fù)序列，作為第二代分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，具有數(shù)量多、分布廣和共顯性等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為分析生物遺傳多樣性和遺傳差異的有效工具［14-15］。豐富的遺傳多樣性是培育優(yōu)良性狀品種的基礎(chǔ)，而明確不同群體間的遺傳距離和遺傳分化水平，對(duì)親本的選擇具有指導(dǎo)意義［16-17］。群體的遺傳多樣性主要表現(xiàn)在等位基因數(shù)的豐富程度、遺傳雜合度的大小和多態(tài)信息含量3個(gè)方面［18］。等位基因越豐富，遺傳雜合度越高，多態(tài)信息含量越高，說(shuō)明群體的遺傳多樣性越豐富。本研究利用12對(duì)微衛(wèi)星DNA對(duì)4個(gè)大口黑鱸群體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論從平均有效等位基因數(shù)還是平均期望雜合度、平均觀測(cè)雜合度、平均多態(tài)信息含量，NG群體的數(shù)值均是最高，表明NG群體的遺傳多樣性最高，其次為GN群體，說(shuō)明通過(guò)雜交方式提高了雜交子代群體的遺傳多樣性。G群體的遺傳多樣性最低，可能是由于其奠基群體數(shù)量較少，連續(xù)多代的選育和自交使得遺傳多樣性出現(xiàn)了降低［19-20］。盡管如此，根據(jù)BOTSTEIN等［21］的劃分標(biāo)準(zhǔn)，大口黑鱸4個(gè)群體的多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50），且兩個(gè)雜交子代群體高于兩個(gè)自交群體，說(shuō)明雜交子代具有一定的雜種優(yōu)勢(shì)和良種選育潛力。

親本間的遺傳距離越大，雜交子代的雜合位點(diǎn)越多，雜交優(yōu)勢(shì)越明顯［22］。檢測(cè)大口黑鱸4個(gè)群體間Ds和Fst發(fā)現(xiàn)，N群體和G群體間的Ds和Fst均較小，其值分別為 0.034和 0.019，親本間遺傳分化較弱。大口黑鱸群體間的雜交方式不同，子代的遺傳表現(xiàn)也不相同。4個(gè)群體的Ds和Fst顯示，NG和GN群體均與N群體的遺傳距離更近，表明N群體對(duì)雜交子代的貢獻(xiàn)率大于G群體。

3.2 4個(gè)大口黑鱸群體的生長(zhǎng)及雜種優(yōu)勢(shì)

雜交可以將不同群體的優(yōu)良性狀集中在一起，我國(guó)魚(yú)類(lèi)雜交育種取得了不少的成果［9，23-24］。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，魚(yú)類(lèi)的雜交可分為遠(yuǎn)緣雜交（不同科、亞科、屬之間的雜交）和近緣雜交（同一物種不同品種、地理群體間的雜交）。關(guān)于大口黑鱸種間雜交的報(bào)道已有不少，但雜交子代在生長(zhǎng)性能上是否具有優(yōu)勢(shì)尚無(wú)定論，例 如：WILLIAMSON 和 CARMICHAEL［25］、PHILIPP和WHITT［26］使用大口黑鱸佛羅里達(dá)亞種和北方亞種雜交，1齡時(shí)北方亞種生長(zhǎng)速度快，雜交種次之；KLEINSASSER等［27］研究表明佛羅里達(dá)亞種♀×北方亞種♂的雜交子代比兩親本的生長(zhǎng)速度更快。種內(nèi)雜交在大口黑鱸中尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，但在其他魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)中已有種內(nèi)雜交優(yōu)勢(shì)的報(bào)道。例如：河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）不同地理群體間的雜交子代的全長(zhǎng)增加率、質(zhì)量增加率、雜交優(yōu)勢(shì)率均高于同一地理群體間的自繁子代［28］。張守都［29］使用海灣扇貝（Argopecten irradias）的加拿大群體和中國(guó)養(yǎng)殖群體進(jìn)行不同地理種群間的雜交，發(fā)現(xiàn)雜交子代在成活率以及生長(zhǎng)上具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)；宋盛亮［30］使用長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）不同地理種群進(jìn)行完全雙列雜交，6個(gè)雜交子代群體均顯示出雜種優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，大口黑鱸種內(nèi)雜交無(wú)論是正交還是反交群體生長(zhǎng)速度均快于親本群體，表明種內(nèi)雜交是提高大口黑鱸生產(chǎn)性能的一個(gè)有效途徑。在生長(zhǎng)性能方面GN群體優(yōu)于NG群體，說(shuō)明在后續(xù)的雜交育種過(guò)程中應(yīng)選擇生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)更大的雜交組合方式。

綜上所述，大口黑鱸北方亞種引進(jìn)群體與“優(yōu)鱸1號(hào)”雜交后，在一定程度上提高了雜交后代的遺傳多樣性。大口黑鱸4個(gè)群體中，GN群體（“優(yōu)鱸1號(hào)”♀ ×北方亞種♂）的生長(zhǎng)速度最快，表現(xiàn)出一定的雜交優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果為大口黑鱸良種培育和遺傳改良提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展提供了一定的技術(shù)資料。