底物大小對(duì)牡蠣幼蟲(chóng)附著的誘導(dǎo)效應(yīng)

范瑞良，李楠楠，王桃妮，2，孫兆躍，2，修玉娜，2，全為民

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

牡蠣是一類(lèi)具有群聚性的雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物［1］，廣泛分布于溫帶河口和濱海區(qū)，如長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）分布于中國(guó)北方沿岸，熊本牡蠣（C.sikamea）主要在江蘇以南沿海［2］，能大量聚集生長(zhǎng)形成牡蠣礁（oyster reef）。牡蠣礁具有凈化水體［3］、維持生物多樣性［4］、提供魚(yú)類(lèi)棲息地［5-8］、能量耦合［9］、防止海岸線侵蝕［10］和碳匯［11］等生態(tài)功能。由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染和病害浸染等，過(guò)去100多年來(lái)全球牡蠣礁分布面積約下降85%［12-13］。此后，為恢復(fù)牡蠣礁生境及其提供的生態(tài)服務(wù)價(jià)值，美國(guó)、澳大利亞和中國(guó)等地陸續(xù)成功開(kāi)展了許多牡蠣礁恢復(fù)項(xiàng)目［6，8，10，14-15］。牡蠣的生長(zhǎng)需要硬質(zhì)的附著基，因此建造適合于牡蠣幼蟲(chóng)附著的棲息生境（礁體）是牡蠣礁恢復(fù)的重點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外牡蠣礁恢復(fù)項(xiàng)目中最常用的底物材料是牡蠣殼，但由于其數(shù)量不足，篩選適合于牡蠣幼蟲(chóng)附著生長(zhǎng)的替代底物成為牡蠣礁恢復(fù)中迫切需要解決的關(guān)鍵技術(shù)之一［10］。

附著底物的物理和化學(xué)性質(zhì)顯著影響海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)的附著和生長(zhǎng)發(fā)育［16-17］，其中底物大小的影響頗受關(guān)注。如FUCHS等［18］的野外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：美洲牡蠣（C.virginica）幼蟲(chóng)更喜歡附著于長(zhǎng)度較短的底物上。JEFERY［19］于野外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：藤壺（Balanus）幼蟲(chóng)單位附著量隨著底物變大依次減少（直徑：6 cm＜3 cm＜1.5 cm）。LILLIS等［20］發(fā)現(xiàn)：鵝卵石大小對(duì)美洲龍蝦（Homarus americanus）幼蟲(chóng)的附著無(wú)顯著影響。實(shí)踐表明，底物大小對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)附著的影響不一。然而，有關(guān)底物大小對(duì)牡蠣幼蟲(chóng)附著的影響鮮有報(bào)道。

熊本牡蠣雖然在我國(guó)有自然分布，但目前還沒(méi)有規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖［21］。因此，室內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為長(zhǎng)牡蠣，室外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是熊本牡蠣。基于以往的研究結(jié)果和野外觀察，本研究提出如下假設(shè)：在低牡蠣幼蟲(chóng)補(bǔ)充下，牡蠣幼蟲(chóng)附著密度與其底物大小呈現(xiàn)正相關(guān)，即隨著底物變大，稚貝附著密度逐步增加。據(jù)此，本研究通過(guò)設(shè)計(jì)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和野外實(shí)驗(yàn)比較3種規(guī)格實(shí)驗(yàn)底物（A：5 cm長(zhǎng)×5 cm寬×3 cm厚、B：10 cm長(zhǎng) ×10 cm寬 ×3 cm厚、C：15 cm長(zhǎng)×15 cm寬×3 cm厚，以下分別簡(jiǎn)稱A、B、C）上牡蠣稚貝附著量，以期確認(rèn)室內(nèi)和野外自然條件下底物大小、兩種實(shí)驗(yàn)環(huán)境及他們之間的交互作用對(duì)牡蠣幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)效果。研究結(jié)果將對(duì)牡蠣礁修復(fù)中替代底物大小的篩選和牡蠣養(yǎng)殖均具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)于2016年5月7日至2016年6月23日在山東省萊州市國(guó)燕水產(chǎn)育苗場(chǎng)（山東萊州虎頭崖鎮(zhèn)西原村）內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)生物為長(zhǎng)牡蠣的幼蟲(chóng)，自受精卵開(kāi)始培育20 d左右至具足面盤(pán)幼蟲(chóng)（pediveliger）階段時(shí)，將實(shí)驗(yàn)底物置于附苗池中開(kāi)展附著實(shí)驗(yàn)。

野外實(shí)驗(yàn)于2018年7月19日至2018年8月19日在浙江省寧波市奉化區(qū)莼湖象山港牡蠣養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)生物為處于具足面盤(pán)階段的熊本牡蠣幼蟲(chóng)。在幼蟲(chóng)附著高峰期（每年7月20日左右）將底物吊掛于潮間帶筏架上開(kāi)展野外附著實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)均采用單因子隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)均設(shè)定3個(gè)底物大小處理組，各個(gè)底物大小處理組之間互為對(duì)照。每個(gè)底物大小處理組設(shè)置10個(gè)重復(fù)，室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)分別總計(jì)3個(gè)處理組合和30個(gè)實(shí)驗(yàn)底物。

實(shí)驗(yàn)底物為河沙和水泥按比例混合制作的混凝土模塊（表1）。每種原料經(jīng)粉碎后過(guò)80目網(wǎng)篩備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在育苗車(chē)間準(zhǔn)備一個(gè)低幼蟲(chóng)豐度（1～2個(gè)·mL-1）附苗池，其上架設(shè)6根竹竿，隨機(jī)選取10個(gè)實(shí)驗(yàn)底物吊掛于竹桿上，使實(shí)驗(yàn)底物位于水面下50 cm處，相鄰實(shí)驗(yàn)底物相距15 cm，相鄰竹桿間相距20 cm。實(shí)驗(yàn)期間，將沙濾后加熱與未加熱海水混合，保持實(shí)驗(yàn)池中的水溫維持在24℃左右（范圍為23.2～24.6℃）、海水鹽度范圍為26.5～27.2，每天于 1∶00、5∶00、9∶00、13∶00、17∶00、21∶00各投餌 1次，投餌量由育苗場(chǎng)管理人員根據(jù)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)狀況而定，餌料為金藻，每天于7∶00和19∶00各換水1次，換水量為附苗池總?cè)萘康?／2，每天光照時(shí)間約為8 h，光照強(qiáng)度為100 lx左右，幼蟲(chóng)附著期間充氣培養(yǎng)等條件均與育苗車(chē)間保持一致。

3 d后，將兩個(gè)附苗池中的實(shí)驗(yàn)底物移置養(yǎng)殖池暫養(yǎng)，直至附著稚貝清晰可見(jiàn)為止（約1個(gè)月），用單反相機(jī)對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)底物表面進(jìn)行拍照，在電腦上計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取20個(gè)附著稚貝，用Photoshop7.0測(cè)量殼高。自牡蠣受精卵至實(shí)驗(yàn)結(jié)束共持續(xù)48 d左右，實(shí)驗(yàn)期間，每天不定期觀察幼蟲(chóng)生長(zhǎng)狀況。

野外實(shí)驗(yàn)：在熊本牡蠣幼蟲(chóng)處于具足面盤(pán)幼蟲(chóng)時(shí)，于2018年7月19日將底物吊掛在搭建的竹竿筏架上，底物位于筏架下50 cm處，其隨漲落潮的露干、淹沒(méi)和餌料等情況與野生牡蠣一致，期間不定期觀察附著情況，待附著稚貝清晰可見(jiàn)為止（約1個(gè)月）。在此期間，實(shí)驗(yàn)海域白天海水溫度范圍為29.9～30.2℃，鹽度范圍為為23.7～25.7。

表1 實(shí)驗(yàn)基質(zhì)組成成分及大小Tab.1 Chem ical com position and sizes of the experimental substrates

考慮到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，僅統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)底物正面附著稚貝的密度和殼高來(lái)顯示牡蠣幼蟲(chóng)的附著效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將每塊實(shí)驗(yàn)底物上附著的稚貝數(shù)量換算成稚貝的密度，統(tǒng)計(jì)每種實(shí)驗(yàn)底物上附著牡蠣稚貝的平均密度（個(gè)·cm-2）和平均殼高（mm）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)以10為底的對(duì)數(shù)函數(shù)處理后，用SPSS 19.0中的 Kolmogorov-Smirnov（以下簡(jiǎn)稱 K-S）正態(tài)檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（P＞0.05，表2），符合正態(tài)分布。處理后數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，使用LSD法進(jìn)行后檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異顯著，P＜0.01時(shí)差異極其顯著；室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)中分別從3個(gè)處理組中隨機(jī)選取10個(gè)密度值及與其對(duì)應(yīng)的殼高，總計(jì)30組數(shù)據(jù)，使用Excel 2013繪制密度與殼高的相關(guān)性分析圖，并采用SPSS 19.0中的Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Sigmaplot10.0軟件繪制折線圖。

表2 K-S正態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果Tab.2 K-S results of normal test

2 結(jié)果與分析

2.1 底物大小對(duì)附著稚貝密度的影響

單因子方差分析結(jié)果表明：無(wú)論室內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是野外實(shí)驗(yàn)，底物大小對(duì)附著稚貝密度的影響均極其顯著（表3，P＝0.000）。

底物大小對(duì)附著稚貝密度的影響結(jié)果如圖1所示。室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)中，A、B、C 3個(gè)處理組間差異極其顯著（圖1，P＜0.01），3個(gè)處理組實(shí)驗(yàn)底物上的附著稚貝密度高低順序?yàn)椋篊＞B＞A。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)附著稚貝的平均密度分別為A組1.06個(gè)·cm-2，B組 5.60個(gè)·cm-2，C組 12.01個(gè)·cm-2；野外實(shí)驗(yàn)附著稚貝的平均密度分別為2.41個(gè)·cm-2，B組 4.65個(gè)·cm-2，C組 6.90個(gè)·cm-2。

圖1 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和野外實(shí)驗(yàn)中3種實(shí)驗(yàn)底物上牡蠣稚貝密度的比較Fig.1 Com parison of oyster spat density on three substrates in laboratory and field experiments（n＝10）

2.2 底物大小對(duì)附著稚貝殼高的影響

單因子方差分析結(jié)果表明：無(wú)論室內(nèi)還是野外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)底物大小對(duì)附著稚貝殼高的影響都極其顯著（表4，P＝0.000）；

表3 底物大小對(duì)附著稚貝密度影響的單因素方差分析結(jié)果Tab.3 One-way ANOVA results of the effect of substrate sizes on settled oyster spat density

底物大小對(duì)附著稚貝殼高的影響結(jié)果如圖2所示，室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)底物處理組間差異極其顯著（圖2，P＜0.01），附著稚貝殼高大小順序?yàn)椋篈＞B＞C。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)附著稚貝的平均殼高分別為A組14.10 mm，B組8.69 mm，C組4.44 mm；野外實(shí)驗(yàn)附著稚貝的殼高分別為A組17.83 mm，B組 11.61 mm，C組7.43 mm。

2.3 室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)附著結(jié)果的比較

雙因子方差分析結(jié)果表明（表5，表6）：2因子交互作用對(duì)附著稚貝密度影響顯著（P＜0.05），對(duì)殼高影響不顯著（P＞0.05）；室內(nèi)和野外的實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)附著稚貝密度影響不顯著（P＞0.05），對(duì)殼高影響顯著（P＜0.05），且野外實(shí)驗(yàn)殼高顯著大于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)的（P＝0.000）。

2.4 牡蠣稚貝密度與殼高之間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和野外實(shí)驗(yàn)中牡蠣稚貝密度與殼高相關(guān)性很強(qiáng)，且為負(fù)相關(guān)。其中，室內(nèi)實(shí)驗(yàn)為極強(qiáng)相關(guān)性（表7，r＝-0.840）；野外實(shí)驗(yàn)為強(qiáng)相關(guān)性 （表 7，r＝-0.726）。

圖2 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和野外實(shí)驗(yàn)3種實(shí)驗(yàn)底物上牡蠣稚貝殼高的比較Fig.2 Com parison of settled oyster spat shell height on three substrates in laboratory and field experiments

表4 底物大小對(duì)附著稚貝殼高影響的單因素方差分析結(jié)果Tab.4 One-way ANOVA results of the effect of substrate sizes on the shell height of settled oyster spat

表5 室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)稚貝附著密度的雙因子方差分析結(jié)果Tab.5 Two-way ANOVA results of settled oyster spat density in laboratory and field experim ents

表6 室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)稚貝附著殼高的雙因子方差分析結(jié)果Tab.6 Two-way ANOVA results of settled shell height of oyster spat in laboratory and field experiments

圖3 室內(nèi)（a）和野外（b）實(shí)驗(yàn)中牡蠣稚貝密度與殼高的相關(guān)性分析圖Fig.3 Analysis of the correlation between shell height and density of oyster spat in laboratory（a）and field experiments（b）

表7 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和野外實(shí)驗(yàn)中密度與殼高的Pearson相關(guān)性分析Tab.7 Pearson correlation analysis of density and shell height in laboratory and field experiments

3 討論

3.1 底物大小對(duì)附著稚貝密度的影響

本研究結(jié)果表明，底物大小顯著影響牡蠣稚貝附著密度，即底物越大，稚貝附著密度越高。主要機(jī)制是底物越大，幼蟲(chóng)接觸機(jī)會(huì)越大，一旦有幼蟲(chóng)附著，就會(huì)釋放化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)其他的幼蟲(chóng)同伴來(lái)此聚集附著［23-24］。如王國(guó)棟等［24］發(fā)現(xiàn)具有更多附著面積的多層結(jié)構(gòu)附著底物對(duì)菲律賓蛤仔 （Ruditapes philippinarum）、青蛤 （Cyclina sinensis）和硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）的附苗效果顯著高于細(xì)砂的結(jié)果解釋了這種可能。LILLIS等［19］研究發(fā)現(xiàn)鵝卵石大小對(duì)美洲龍蝦幼蟲(chóng)附著的影響不顯著。ADAMIAK-BURD等［25］發(fā)現(xiàn)水蛭幼蟲(chóng)更易附著于尺寸較小的底物上。這可能是由于物種間的差異。歐微龍等［26］的研究表明2種規(guī)格的底物大小對(duì)葉片山海綿的附著量差異不顯著，其可能是2種底物的有效附著面積均能夠滿足葉片山海綿的生長(zhǎng)，為本研究的設(shè)計(jì)思路提供了方向，并為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了解釋的空間。FUCHS等［17］野外研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)度較短的底物上美洲牡蠣稚貝附著量較多，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同。可能是由于實(shí)驗(yàn)海區(qū)的幼蟲(chóng)豐度遠(yuǎn)少于室內(nèi)養(yǎng)殖的。大多數(shù)牡蠣幼蟲(chóng)會(huì)附著在鄰近的優(yōu)勢(shì)底物上，大底物雖然增加了幼蟲(chóng)接觸的可能性，但降低了底物上的單位稚貝附著量。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)A處理組的附著稚貝密度低于野外實(shí)驗(yàn)可能是由于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)暫養(yǎng)時(shí)海水中沒(méi)有幼蟲(chóng)，而野外實(shí)驗(yàn)中一直有幼蟲(chóng)再次附著到底物上。本研究的結(jié)果是基于低幼蟲(chóng)密度的環(huán)境，如果幼蟲(chóng)密度高時(shí)，這種底物大小對(duì)幼蟲(chóng)附著的誘導(dǎo)效應(yīng)會(huì)顯著降低。

3.2 附著稚貝殼高和密度的相關(guān)性

附著稚貝殼高與密度呈負(fù)相關(guān)。很多研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，如杜美榮［27］研究發(fā)現(xiàn)底棲硅藻處理組附著底物上櫛孔扇貝（Chlamys farreri）稚貝附著量明顯多于常規(guī)方法處理組，稚貝殼高結(jié)果卻與附著量相反。陳璐等［28］研究發(fā)現(xiàn)密鱗牡蠣（Ostrea enselamellosa）幼蟲(chóng)高豐度 （3個(gè)·mL-1和4個(gè)·mL-1）處理組底物上稚貝的附著效果優(yōu)于低豐度處理組（1個(gè)·mL-1和2個(gè)·mL-1），生長(zhǎng)速度卻明顯慢于低豐度處理組。因?yàn)殡S著稚貝附著密度的增大，食物、空間競(jìng)爭(zhēng)壓力增大，導(dǎo)致個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。野外實(shí)驗(yàn)中附著稚貝密度低于其在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)的密度、殼高卻高于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)也可能是這個(gè)原因?qū)е碌?。后期幼蟲(chóng)附著密度等外界條件可能會(huì)造成殼高的差異，所以，底物大小與后期殼高之間直接相關(guān)性不大。密度是牡蠣稚貝生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一，貝殼生長(zhǎng)還與鹽度、溫度等環(huán)境條件密切相關(guān)，如王濤等［29］的鹽度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽度15、20和25組中熊本牡蠣稚貝殼高顯著高于鹽度35和40組；溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，稚貝殼高在溫度28℃組顯著高于溫度16℃、20℃、24℃和32℃組。饒科等［30］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) pH為 8.1～7.0時(shí)，近江牡蠣（C.ariakensis）的鈣化率隨著pH的下降而顯著下降。

3.3 室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

通過(guò)室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)附著稚貝密度影響不顯著，而其與底物大小的交互作用對(duì)密度影響顯著，可能是由于牡蠣幼蟲(chóng)對(duì)附著底物的選擇性優(yōu)于環(huán)境條件的差異。實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)附著稚貝殼高影響顯著，這個(gè)可能有兩種原因，一種是幼蟲(chóng)豐度的不同，導(dǎo)致附著密度的不同，從而影響稚貝殼高［28］；另一種是野外實(shí)驗(yàn)的環(huán)境更適宜牡蠣的生長(zhǎng)。兩種因子的交互作用對(duì)殼高影響不顯著，可能是環(huán)境條件差異對(duì)殼高的影響大于底物大?。ɑ蛑韶惷芏龋?duì)其的影響。

3.4 小結(jié)

本研究表明，在低幼蟲(chóng)密度下，底物大小與牡蠣稚貝附著密度呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。因此，在牡蠣礁生態(tài)修復(fù)中，底物大小是必須特別考慮的因子之一，選擇適合規(guī)格的底物可顯著提高礁體上牡蠣幼蟲(chóng)附著量，從而影響牡蠣礁生態(tài)修復(fù)的效果。

本實(shí)驗(yàn)僅證明底物大小對(duì)牡蠣幼蟲(chóng)附著影響顯著，并未驗(yàn)證幼蟲(chóng)附著的最適底物規(guī)格，仍需下一步進(jìn)行研究。

致謝：感謝育苗場(chǎng)工作人員在實(shí)驗(yàn)期間提供的幫助，楊杰青等在論文寫(xiě)作中給予的指導(dǎo)。