SurA 通過調(diào)控鞭毛表達影響傷寒沙門菌生物膜的形成*

韓海霞，徐蕓蕓，劉 超，陸仁飛*

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗科，南通 226006)

傷寒沙門菌是腸桿菌科細菌研究的一種重要模式細菌[1]。傷寒沙門菌感染人類主要引起腸熱癥，經(jīng)血流擴散后最終會引起菌血癥等其他系統(tǒng)性疾病[2]。細菌在環(huán)境中通常不是以單個細菌樣式的浮游生長，而是大量細菌聚集在一起生長，以應(yīng)對復(fù)雜的生存環(huán)境，細菌通過鞭毛、菌毛及自身分泌的多糖、纖維素、脂質(zhì)蛋白等基質(zhì)，相互黏附聚集形成高度組織化的膜樣聚合結(jié)構(gòu)，即生物膜[3]?？v觀傷寒沙門菌污染食物、胞內(nèi)生存，膽囊長期定植等幾個造成嚴重危害的關(guān)鍵節(jié)點，細菌都有以生物膜生長的形式，生物膜無疑成了最主要的“幫兇”。細菌在食物表面以生物膜的形式存在，可以克服低溫、干燥、消毒等不利因素[4]；細菌在單核巨噬細胞內(nèi)形成生物膜以抵御低滲、強酸及氧化殺傷，最終隨著被感染的巨噬細胞進一步擴散[5]；細菌能在膽囊膽結(jié)石表面形成生物膜抵御膽汁、抗生素對其的損傷而長期存活[6]。另外，大量研究[7]表明生物膜內(nèi)的細菌大部分是以“滯留菌”的形式存在，這是一種對目前任何抗生素都不敏感的“休眠期”細菌，因此細菌生物膜已經(jīng)成為處理傷寒沙門菌感染或其他細菌感染最關(guān)鍵和最棘手的問題。

早在1990年，就發(fā)現(xiàn)surA 基因是細菌穩(wěn)定期生長必不可少的[8]。6年后，SurA 被證明是一種位于細胞內(nèi)外膜之間的一種類小蛋白樣肽基-脯氨酰異構(gòu)酶，主要作用是運送和組裝外膜β-片層蛋白從胞漿通過周質(zhì)到達外膜，與外膜組裝蛋白協(xié)同作用，生成外膜蛋白[9-12]。本課題組前期傷寒沙門菌生物膜環(huán)境細菌和指數(shù)生長期細菌的RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，2個轉(zhuǎn)錄組有279 個差異表達的基因，其中，差異表達上調(diào)前20 的基因中有5 個是外膜蛋白基因。因此，外膜蛋白在生物膜細菌中高表達，根據(jù)SurA 已報道的功能(對外膜蛋白在周質(zhì)中的運送及正確折疊組裝至關(guān)重要)，推測周質(zhì)伴侶蛋白SurA 可能與生物膜的形成有關(guān)系。為此，我們構(gòu)建了surA 基因的缺陷株以及回補株，觀察了surA 基因缺陷株、野生株以及回補株的生物膜形成能力，再進一步對SurA 影響生物膜形成能力的機制進行探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 傷寒沙門菌野生型(Wild Type,WT)GIFU10007 由日本岐阜大學惠贈。低拷貝阿拉伯糖可誘導(dǎo)載體pBAD 購自Invitrogen 公司。E.coli DH5α 由本實驗室保存。surA 基因缺陷株(△surA)、flhD 基因缺陷株(△flhD)、surA 基因缺陷空載體株(△surA-pBAD)、野生空載體株(WT-pBAD)、surA 基因缺陷回補株(△surA-psurA)由本實驗室制備和保存。

1.1.2 材料和試劑 胰蛋白胨、酵母浸膏和TSB 培養(yǎng)基購自O(shè)XOID 公司；NaCl、無水乙醇和異丙醇購自國藥集團；Trizol 購自Invitrogen 公司；L-阿拉伯糖、氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)和瓊脂糖購自Sigma 公司；聚苯乙烯96 孔板購自CORNING 公司；DNA 酶Ⅰ基因組消化試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR實時熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊公司。

1.1.3 主要儀器 NanoDrop ND-1000 微量核酸定量儀(Thermo)；普通聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(ABI 2720)；熒光定量PCR 儀、酶標儀(Bio-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)傷寒沙門菌野生株GIFU10007 基因組信息(本實驗室測序，未公布)，設(shè)計實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)定量引物，引物由蘇州泓迅生物公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 缺陷株及回補株的構(gòu)建 Red 重組法制備surA 基因缺陷株，缺陷株以及回補株的構(gòu)建同參考文獻[13-14]。

1.2.3 細菌培養(yǎng) 將傷寒沙門菌單菌落分別接種于2 mL LB 液體培養(yǎng)基(根據(jù)需要添加相應(yīng)抗生素)，37 ℃、250 r/min 震蕩培養(yǎng)過夜。第2 天，1∶100 轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基(添加相應(yīng)抗生素和適當濃度阿拉伯糖)，37 ℃、250 r/min 震蕩培養(yǎng)至所需的吸光度。

1.2.4 細菌生物膜實驗(結(jié)晶紫) 將過夜培養(yǎng)的細菌(WT-pBAD、△surA-pBAD、△surA-psurA)1∶100 轉(zhuǎn)接到20 mL TSB 培養(yǎng)基中(Amp 終濃度100 μg/mL，阿拉伯糖終濃度0.1%)繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.2，吸取200 μL菌液于無菌聚苯乙烯96 孔板內(nèi)，孵箱30 ℃靜置培養(yǎng)約96 h，培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄聚苯乙烯96 孔板內(nèi)菌液，無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗孔內(nèi)3 次后烘干，結(jié)晶紫溶液對生物膜染色15 min，加入250 μL 30%乙酸溶液溶解生物膜，酶標儀A570 波長測定每孔吸光度。

1.2.5 qRT-PCR 將過夜培養(yǎng)的細菌(WT 和△surA)1∶100 轉(zhuǎn)接到20 mL LB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至指數(shù)中期OD600=0.6，冰上放置10 min，4 000 r/min 離心10 min 收集細菌。Trizol 法提取細菌總RNA，經(jīng)DNA酶Ⅰ消化基因組DNA 后，隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，同時設(shè)置不加逆轉(zhuǎn)錄酶參照孔。以cDNA 為模板，用上下游引物進行qRT-PCR，方法參照說明書，實驗每次3 個復(fù)孔，批間重復(fù)3 次，5s rRNA 為內(nèi)參基因，基因表達量采用2-△△ct法計算。每次實驗均設(shè)對照組和實驗組。

1.2.6 電鏡觀察細菌鞭毛 將過夜培養(yǎng)的細菌(WT、△surA 和△flhD)繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)早期OD600=1.2，菌液冰上放置，送揚州大學農(nóng)學院生物樣本分析中心透射電鏡室做電鏡拍攝。

2 結(jié) 果

2.1 傷寒沙門菌surA 基因缺陷下調(diào)細菌生物膜形成能力 傷寒沙門菌生物膜結(jié)晶紫實驗顯示，與野生株(WT-pBAD)相比，缺陷株(△surA-pBAD)生物膜形成能力為野生株(WT-pBAD)的50%，而在缺陷株里回補了surA 基因后，回補株(△surA-psurA)的生物膜形成能力又恢復(fù)到野生株水平，說明傷寒沙門菌surA 基因缺陷具有下調(diào)細菌生物膜形成的能力(圖1)。

2.2 傷寒沙門菌surA 基因缺陷下調(diào)鞭毛相關(guān)基因表達 為了探索周質(zhì)伴侶蛋白SurA 影響生物膜形成的機制，我們通過qRT-PCR 檢測影響傷寒沙門菌生物膜形成的幾個胞外基質(zhì)及關(guān)鍵調(diào)控子在野生株(WT)和缺陷株(△surA)中的表達水平。實驗結(jié)果顯示，與WT 株相比，△surA 菌株中鞭毛相關(guān)基因(flhD、fliA、fljB)的mRNA 水平顯著下調(diào)，其中flhD 和fliB 的mRNA 水平下降為野生株的25%，fljA mRNA水平下降到野生株的10%(圖2)。說明surA 基因缺陷后下調(diào)傷寒沙門菌鞭毛表達。

表2 生物膜形成相關(guān)基質(zhì)成分與基因

2.3 電鏡觀察surA 基因缺陷對細菌鞭毛表達的影響 為觀察surA 基因缺陷對細菌鞭毛表達的影響，對WT、△surA 及△flhD 菌株進行電鏡觀察。WT 菌株的鞭毛數(shù)約5～8 根(圖3A～C)；而△surA 菌株的鞭毛數(shù)僅2～3 根，由于動力減弱，通常2～3 個細菌聚集生長(圖3D～F)；由于缺失了鞭毛一級調(diào)控子FlhD，△flhD 菌株周身無鞭毛，細菌成簇生長(圖3G～I)。說明缺失surA 基因后，傷寒沙門菌鞭毛表達的數(shù)量明顯減少。

2.4 傷寒沙門菌鞭毛是細菌形成生物膜必不可少的基質(zhì) 為觀察傷寒沙門菌鞭毛和細菌生物膜形成能力的關(guān)系，利用鞭毛一級調(diào)控子FlhD 的缺陷株進行生物膜實驗。如圖4 所示，鞭毛缺失菌株(△flhD)的生物膜形成能力顯著低于WT 菌株；甚至低于△surA 菌株的生物膜形成能力。考慮到我們已經(jīng)證明傷寒沙門菌surA 基因缺陷下調(diào)鞭毛相關(guān)基因表達，因此傷寒沙門菌surA 基因缺陷可能通過下調(diào)鞭毛基因表達來影響生物膜形成。

3 討 論

細菌生物膜形成大致可分為3 個階段：(1)早期黏附階段，細菌游動聚集到有機或無機物表面，依賴鞭毛和菌毛相互黏附或黏附在固著物表面[15]；(2)中期細菌聚集群落形成，細菌開始分泌Curli 菌毛、纖維素、克拉酸、Bap 蛋白和胞外核酸等胞外基質(zhì)，這些胞外基質(zhì)堆積在細菌鞭毛和菌毛構(gòu)建的“腳手架”樣細菌群落上[16-18]；(3)晚期為生物膜成熟期，更多的細菌和胞外基質(zhì)黏附在一起，生物膜厚度和體積越來越大，內(nèi)部營養(yǎng)和氧氣也越來越匱乏，細菌處于“休眠”狀態(tài)，這些細菌為了節(jié)約能量，幾乎不表達鞭毛等器官。處于生物膜表面的少量細菌受外部營養(yǎng)物或氧氣的“引誘”，開始脫離生物膜，重新成為浮游生長的細菌[19]。生物膜形成早期依賴鞭毛的表達；生物膜中晚期細菌鞭毛低表達。鞭毛高表達促進早期生物膜形成，鞭毛高表達后運動能力增強又增加了生物膜的消散，那么總體上鞭毛對于細菌生物膜形成是“利”還是“弊”呢？我們發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌缺失鞭毛一級調(diào)控子基因flhD 后，細菌幾乎全部喪失形成生物膜的能力，因此推測鞭毛對于生物膜形成是必不可少的基質(zhì)。

SurA 主要作用是運送和組裝外膜β-片層蛋白從胞漿通過周質(zhì)到達外膜，與外膜組裝蛋白協(xié)同作用，形成外膜蛋白，因此surA 基因缺陷后可能會導(dǎo)致外膜損傷。E.coli 中，周質(zhì)中錯誤折疊的外膜蛋白堆積，導(dǎo)致誘導(dǎo)RpoE 介導(dǎo)的壓力反應(yīng)，而RpoE 介導(dǎo)的壓力反應(yīng)上調(diào)細菌的鞭毛表達[20]，這與本研究結(jié)果surA 基因缺陷后上調(diào)鞭毛表達結(jié)果相反，因此surA 基因缺陷上調(diào)鞭毛表達必然不是通過RpoE 介導(dǎo)的通路。外膜損傷可激活雙組份系統(tǒng)Rcs 活化[21]，活化的Rcs 系統(tǒng)負調(diào)控鞭毛表達[22]，那么surA 基因缺陷后，是否能激活Rcs 系統(tǒng)活化？這種假設(shè)需進一步證明。

周質(zhì)伴侶蛋白SurA 功能具有多效性，其對于外膜蛋白的正確折疊及組裝是必不可少的，且可影響自轉(zhuǎn)運黏附素Ag43 和菌毛的生成，SurA 還影響大腸埃希菌屬，沙門菌屬和志賀菌屬生物膜形成和致病性。此外，鑒于SurA 的高度保守性，SurA 可能在其他革蘭陰性細菌中扮演相似的角色。因此，未來SurA 有可能成為針對革蘭陰性病原體有價值的藥物靶標。