復(fù)合預(yù)混合飼料中β-胡蘿卜素測(cè)定方法研究

施杏芬，呂偉軍，陳 凱，阮 鑫

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 311199）

β-胡蘿卜素是一種重要的營(yíng)養(yǎng)性添加劑和天然色素，不僅具有維生素A 的生物活性，而且在增強(qiáng)免疫及抗氧化等方面都有顯著的功效，廣泛應(yīng)用于食品和動(dòng)物養(yǎng)殖中。在畜禽養(yǎng)殖中添加β-胡蘿卜素可增強(qiáng)動(dòng)物的免疫能力，提高成活率，并且可改善動(dòng)物產(chǎn)品的色澤，從而提高其產(chǎn)品的附加值。農(nóng)業(yè)部2625 號(hào)公告《飼料添加劑安全使用規(guī)范》中規(guī)定β-胡蘿卜素作為維生素類添加劑，可以在養(yǎng)殖動(dòng)物中添加使用，但其作為著色劑只允許在家禽中按生產(chǎn)需要適量使用?；瘜W(xué)合成著色劑毒性 ADI 0～0.03 （FAO／WHO，2001），半致死量 （LD50）＞10 g/kg (小鼠，經(jīng)口）（顧君華，2007）。目前，還沒(méi)有一種飼料中β-胡蘿卜素的測(cè)定方法。因此，為從源頭控制畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，監(jiān)控復(fù)合預(yù)混合飼料中β-胡蘿卜素的添加水平，建立相應(yīng)的分析測(cè)定方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、 試劑和材料 Aglient 1260 高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器；分析天平，梅特勒；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI 公司；旋渦儀，TALBYSTM。

全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%，北京曼哈格生物科技有限公司；甲醇、色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇、色譜純，默克股份有限公司；二氯甲烷、色譜純，天地股份有限公司；石油醚（沸程 30～60 ℃）、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀、氯化鈉，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、L-抗壞血酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈超純水；尼龍針式過(guò)濾器 WAT200520（0.45 μm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品50 mg 至100 mL 棕色容量瓶中，加入10 mL二氯甲烷溶解并定容 （GB 5009.83-2016），配成500 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。稀釋配成0.00、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 HPLC 分析條件 色譜柱：Aglient SB-C18柱，長(zhǎng) 250 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，粒徑 5 μm；流速：1.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3（V/V/V）。

1.4 樣品處理 稱取1 g 復(fù)合預(yù)混合飼料于已加入1 g EDTA 的三角瓶中，加入50 mL L-抗壞血酸乙醇溶液，加入10 mL 氫氧化鉀溶液，于50 ℃水浴超聲20 min。將該溶液轉(zhuǎn)移至盛有80 mL 石油醚的分液漏斗中，用水洗三角瓶并入分液漏斗。水相轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗中，用50 mL 石油醚重復(fù)提取兩次。用100 mL 飽和氯化鈉溶液洗滌提取液，并用水洗滌提取液至中性，過(guò)無(wú)水硫酸鈉，轉(zhuǎn)移至放有幾粒BHT 的棕色容量瓶中，用石油醚定容。分取一定體積于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器燒瓶，減壓濃縮至近干，用流動(dòng)相溶解，旋渦混勻。過(guò) 0.45 μm 濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析圖譜 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1，空白復(fù)合預(yù)混合飼料色譜圖見(jiàn)圖2，添加β-胡蘿卜素的復(fù)合預(yù)混合飼料色譜圖見(jiàn)圖3。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖2 空白樣品

圖3 加標(biāo)樣品

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示β-胡蘿卜素濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程與相關(guān)系數(shù)

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 在空白的復(fù)合預(yù)混合飼料中分別添加 β-胡蘿卜素 2、752、1500 mg/kg三個(gè)濃度，每個(gè)濃度6 個(gè)重復(fù)，平均回收率為95%～102%，批內(nèi) RSD 小于 6%，批間 RSD 小于 4%（表2）。

表2 復(fù)合預(yù)混合飼料中β-胡蘿卜素的回收率測(cè)定結(jié)果

2.4 檢測(cè)限和定量限 用本研究方法測(cè)定復(fù)合預(yù)混合飼料中β-胡蘿卜素含量，其檢測(cè)限按S/N≥3，為 1 mg/kg；定量限按 S/N≥10，為 2 mg/kg，由表2 可見(jiàn)，添加濃度為2 mg/kg 時(shí)，其平均回收率為101.7%，批內(nèi)RSD 為5.37%，說(shuō)明該方法檢測(cè)性能較好。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 選用不同品牌的C8、C18 色譜柱，按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中胡蘿卜素的測(cè)定（GB 5009.83-2016）中的色譜條件二測(cè)定，大部分色譜峰都有拖尾，只有Aglient ZORBA SB C18 色譜峰對(duì)稱較好，幾乎沒(méi)有拖尾。因此確定Aglient ZORBA SB-C18 柱作為β-胡蘿卜素的檢測(cè)色譜柱。

3.2 流動(dòng)相的選擇 由于β-胡蘿卜素可溶于丙酮、三氯甲烷、石油醚等，難溶于甲醇和乙醇。通過(guò)比較甲醇+乙腈+三氯甲烷=85+12+3(GB 5009.83-2016)、甲醇+乙腈+三氯甲烷=85+12+3（1000 mL中1.0 mL 三氟乙酸）、甲醇+異丙醇=82+18、甲醇+異丙醇=85+15、甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3幾組流動(dòng)相，只有甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3 的流動(dòng)相色譜峰比較對(duì)稱和尖銳，因此，選擇甲醇+異丙醇+二氯甲烷作為研究的流動(dòng)相。

3.3 提取試劑的選擇 由于β-胡蘿卜素對(duì)光、熱、氧不穩(wěn)定，不耐酸，弱堿性時(shí)較穩(wěn)定，用堿液皂化后，分別用環(huán)己烷、氯仿、石油醚等溶液提取，發(fā)現(xiàn)石油醚萃取時(shí)回收率比較穩(wěn)定，故選用石油醚作為萃取液。

3.4 實(shí)際樣品檢測(cè) 對(duì)添加400 mg/kg β-胡蘿卜素的復(fù)合預(yù)混合飼料進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果為391 mg/kg。

4 結(jié)論

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的一種，屬于脂溶性化合物，直接提取回收率不高，故本試驗(yàn)采用堿液皂化，石油醚萃取，建立了復(fù)合預(yù)混合飼料中β-胡蘿卜素的測(cè)定高效液相色譜法，結(jié)果表明復(fù)合預(yù)混合飼料中添加β-胡蘿卜素濃度為2～1500 mg/kg 時(shí)，其回收率均在 95%以上，RSD 小于6%。該方法穩(wěn)定性好，分離度高，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，可以滿足日常的檢測(cè)需求。