ICP-MS法測定柴胡注射液中18種重金屬及有害元素*

張 丹，王留留，李 凱

(1.鄭州市食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450006； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046)

柴胡注射液為北柴胡經(jīng)水蒸氣蒸餾后，加聚山梨酯80和氯化鈉等制成的中藥注射劑，具有清熱解表的功效，用于治療感冒、流行性感冒及瘧疾等的發(fā)熱[1]。柴胡注射液的療效確切，臨床應(yīng)用至今已七十多年[2]。近年來，有關(guān)柴胡注射液的藥品不良反應(yīng)的報道不斷增加，其中嚴重的不良反應(yīng)為過敏性休克，可危及患者生命[3-9]。與其他制劑相比，中藥注射劑不經(jīng)消化吸收直接進入血液，風險較高，而重金屬及有害元素是中藥制劑毒副作用的來源之一[10-11]。因此，對中藥注射劑的重金屬及有害元素的檢測和限量控制十分重要?！吨袊幍洹?2015版)四部通則0102注射劑中重金屬及有害元素殘留量[12]4-6項下僅規(guī)定了Pb、Cd、As、Hg、Cu 5種元素的限量，而未對其他重金屬元素殘留量進行監(jiān)控。本研究參考國際人用藥物注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議(ICH) Q3D(R1)[13]、《中國藥典》(2015 版)四部通則9302[12]402-404，以及《美國藥典》(USP)通則<232>[14]的相關(guān)要求，建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法同時測定柴胡注射液中18種元素含量的檢測方法，實現(xiàn)了多元素的同時測定，并擬定了本品中18種元素的限度。該方法操作簡便，準確可靠，專屬性強，靈敏度高，可對柴胡注射液中重金屬及有害元素殘留量進行監(jiān)控，為其他中藥注射劑中重金屬及有害元素殘留的檢測提供了有益借鑒，為相關(guān)藥品的風險監(jiān)控提供了可靠依據(jù)。

1 藥品、試劑與儀器

柴胡注射液，河南潤弘藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，2 mL/支，批號1803252，1904211，1904281，1904282；輔仁藥業(yè)集團有限公司產(chǎn)品，批號2003091，2003101，2003111；信合援生制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號1907091，1911011；河南福森藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號2001151。

Al、As、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、P、Pb、Pt、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn多元素標準溶液，國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供，100 mg/L，批號20D3095；銀(Ag，批號19C046-3)、鈧(Sc，批號184017)、鍺(Ge，批號192037)、銦(In，批號191009)、鉍(Bi，批號191016-2)、金(Au，批號19C003-2)單元素標準溶液，國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供，1 000 mg/L；Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U調(diào)諧液，德國Thermo Scientific公司產(chǎn)品，1.0 μg/L，批號7684；硝酸，優(yōu)級純，美國SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品，批號STBG6502；水為純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司產(chǎn)品，批號20191003；ICAP-Q 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；Multiwave PRO微波消解儀，奧地利Anton Paar公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器參數(shù)

2.1.1 ICP-MS參數(shù)

等離子體功率1 550 W，冷卻氣流量14.0 L/min，輔助氣流量0.80 L/min，碰撞氣流量4.83 mL/min，霧化器流量1.06 L/min，霧化器壓力2.47 bar，霧化室溫度2.70 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速40 r/min，冷卻水流量 0.68 L/min，矩管水平位置0.43 mm，矩管垂直位置 0.39 mm，采樣深度5.0 mm，每點滯留時間0.02 s，數(shù)據(jù)采集模式為KED，數(shù)據(jù)采集方式為跳峰，重復(fù)次數(shù)為3次。

2.1.2 微波消解程序

見表1。

表1 微波消解程序

2.2 溶液制備

2.2.1 混合標準溶液制備

精密量取Al、As…… Zn多元素標準溶液和Ag單元素標準溶液適量，用體積分數(shù)20 mL/L的硝酸溶液稀釋制成質(zhì)量分數(shù)均為1 mg/L的混合標準儲備溶液。臨用時分別精密量取上述混合標準儲備溶液適量，用20 mL/L硝酸溶液稀釋制成質(zhì)量分數(shù)分別為0.1,0.5,1,5,10,20,50 μg/L的系列混合標準溶液。

2.2.2 內(nèi)標溶液制備

分別精密量取Sc、Ge、In和Bi單元素標準溶液適量，用體積分數(shù)20 mL/L 的硝酸溶液稀釋制成質(zhì)量分數(shù)均為500 μg/L的混合內(nèi)標溶液。

2.2.3 Au元素標準溶液制備

精密量取Au單元素標準溶液適量，用體積分數(shù)20 mL/L 的硝酸溶液稀釋制成質(zhì)量分數(shù)為1 mg/L的溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液制備

精密量取供試品0.5 mL，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸6 mL，密閉并按2.1.2項下的微波消解程序進行消解。消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，在130 ℃趕酸至約1 mL，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入Au單元素標準溶液(1 mg/L)200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 試劑空白溶液制備

除不加Au單元素標準溶液外，按2.2.4項下供試品溶液制備方法制備即可。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

取2.2.1項下系列混合標準溶液，按2.1.1項下方法測定，以內(nèi)標元素校正過的各元素響應(yīng)值為縱坐標(Y)，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得到回歸方程，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，各元素在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 檢出限及定量限

取2.2.5項下試劑空白溶液，按2.1.1項下方法連續(xù)測定11次，以其響應(yīng)值的3倍的標準偏差除以相應(yīng)元素標準曲線的斜率作為各元素的檢出限(LOD)，以其響應(yīng)值的10倍的標準偏差除以相應(yīng)元素標準曲線的斜率作為各元素的定量限(LOQ)，結(jié)果見表2。

表2 待測元素線性關(guān)系、檢出限、定量限和精密度

2.3.3 精密度試驗

取2.2.1項下的混合標準溶液(10 μg/L)，按2.1.1項下條件重復(fù)測定6次，計算各元素的RSD。結(jié)果：Li、Al、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Mo、Ag、Cd、Sn、Sn、Ba、Hg、Pb的RSD分別為0.8%、2.6%、1.3%、0.8%、0.5%，5.7%、1.2%、0.9%、4.0%、1.3%、0.8%、1.5%、0.5%、0.6%、1.0%、1.5%、2.3%、1.2%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取同一批柴胡注射液(批號1904282)6份各0.5 mL，分別精密加入混合標準儲備液0.5 mL，按2.2.4項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項下條件分別測定。結(jié)果：Li、Al、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Mo、Ag、Cd、Sn、Sn、Ba、Hg、Pb的RSD分別為0.9%、2.1%、1.5%、1.1%、1.8%、3.3%、1.2%、1.8%、1.7%、2.4%、0.8%、1.6%、2.1%、0.4%、1.2%、0.5%、0.6%、1.1%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密量取同一批柴胡注射液(批號1904282)各0.5 mL，分別置耐壓耐高溫微波消解罐中，共9份，分為3組，每組3份平行樣。分別精密加入混合標準儲備液0.25，0.5，0.75 mL，按2.2.4項下方法制備加樣供試品溶液，按2.1.1項下條件進樣測定，計算回收率及其RSD。結(jié)果：Li、Al、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Mo、Ag、Cd、Sn、Sn、Ba、Hg、Pb的平均加樣回收率分別為85.5%、89.8%、92.8%、85.7%、85.7%、89.8、82.1%、88.3%、112.8%、87.9%、100.7%、103.1%、91.6%、92.6%、88.1%、96.7%、101.2%、101.3%，RSD分別為1.6%、1.6%、3.0%、0.8%、1.2%、3.5%、1.0%、1.9%、2.3%、1.9%、0.9%、1.8%、1.2%、0.8%、1.2%、2.5%、3.2%、0.9%。結(jié)果表明，該方法準確度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批柴胡注射液(批號1904282)，按2.2.4項下方法制備供試品溶液，在4 ℃條件下保存，分別在0，2，4，8，12，24 h，按2.1.1項下條件進樣測定。結(jié)果：各元素的響應(yīng)值的RSD分別為1.8%、3.0%、2.3%、1.8%、2.5%、2.1%、1.9%、2.2%、2.4%、2.8%、1.2%、2.0%、2.3%、0.7%、1.4%、0.7%、0.9%、1.7%。結(jié)果表明，該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 供試品含量測定

取10批柴胡注射液，分別按照2.2.4項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下條件進樣測定，通過回歸方程計算含量，結(jié)果見表3。

表3 供試品含量測定結(jié)果 mg·L-1,n=3

3 討 論

3.1 供試品前處理方法

柴胡注射液中含有聚山梨酯80，黏度較大，基質(zhì)較復(fù)雜，可能影響霧化和電離效率，進而影響測定準確性。在考察供試品前處理方法時，分別考察了直接稀釋和微波消解兩種方法。在加樣回收率試驗中，直接稀釋法的回收率較低，可能是由于在進樣時供試品微粒不能均勻地分散于載氣中；微波消解法利用高壓高溫消解和微波快速加熱，具有環(huán)境污染小、消解速度快、消解完全充分、回收率高的特點；因此，本試驗采用微波消解法處理供試品。

微波消解后要進行加熱趕酸，加熱溫度應(yīng)低于130 ℃，因為經(jīng)長期大量的實驗發(fā)現(xiàn)，Hg元素在加熱溫度不超過130℃情況下回收率基本保持穩(wěn)定；超過130 ℃時Hg元素會揮發(fā)，影響測定結(jié)果準確性。

在檢測過程中，Hg易產(chǎn)生記憶效應(yīng)，因為其具有極強的吸附性，容易吸附在樣品瓶、泵管及矩管上。Hg可以溶解多種金屬，與之形成汞齊，溶解度越大，形成的汞齊越穩(wěn)定，越不易吸附在容器或管線表面；但溶解度過大，形成的汞齊在等離子體中難以分解離子化。因為Au在Hg中具有一定的溶解度，能夠形成金汞齊，所以在供試品溶液中加入Au可消除Hg的記憶效應(yīng)，提高結(jié)果的穩(wěn)定性。

3.2 檢測元素的選擇及限量

《中國藥典》2015版四部通則0102[6]注射劑項下重金屬及有害元素殘留量中規(guī)定了按各品種項下每日最大使用量計算，中藥注射劑中Pb、Cd、As、Hg、Cu的殘留量分別為不得超過12，3，6，2，150 μg?！吨袊幍洹?015版四部通則9302中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則[14]規(guī)定，重金屬及有害元素主要是指Pb、Hg、Cd、Cu、Ag、Bi、Ti、Sn、As等。《中國藥典》2015版四部通則9304中藥中Al、Cr、Fe、Ba元素測定指導(dǎo)原則[12]406-407，中藥在種植、生產(chǎn)、加工等過程中可能會引入Al、Cr、Fe、Ba 等金屬元素，其含量過高可能會帶來潛在危害。柴胡注射液的元素雜質(zhì)可能由原料飲片引入，因此，也應(yīng)對制劑中的元素雜質(zhì)進行監(jiān)控。

國際人用藥物注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議(ICH)Q3D[13]基于元素毒性及在藥品中出現(xiàn)的可能性，將元素分為3類。第一類：As、Cd、Hg和Pb。這些元素對人有毒，藥品生產(chǎn)中不得使用或限制使用，所有給藥途徑的風險評估中都必須評價這4種元素。第二類：2A類包括Co、Ni、V。這些元素在制劑中出現(xiàn)的可能性較高，需要對所有潛在來源和給藥途徑進行風險評估。2B類包括Ag、Au、Ir、Os、Pd、Pt、Rh、Ru、Se、Tl，這些元素在自然界中稀少，在藥品中出現(xiàn)的可能性較低。除非在原料藥、賦形劑或藥品的其他組分生產(chǎn)中有意添加，否則不需要對它們進行風險評估。第三類：Ba、Cr、Cu、Li、Mo、Sb、Sn。對于生產(chǎn)中非有意添加的這些元素，其中Li、Sb、Cu在注射和吸入給藥時需進行風險評估；Ba、Cr、Mo、Sn僅需在吸入給藥時進行評價。其中規(guī)定了按每日最大使用量計算，Co、Ni、V、Ag、Ba、Cr、Li、Mo、Sb、Sn的殘留量分別為不得超過5，10，20，10，700，1 100，250，1 500，90，600 μg。

《美國藥典》(USP)通則<232>[15]規(guī)定了24種金屬元素雜質(zhì)(Cd、Pb、As、Hg、Ir、Os、Pd、Pt、Rh、Ru、Cr、Mo、Ni、V和Cu)的每日允許接觸限值(PDE)。其中鉑族元素Ir、Os、Pd、Pt、Rh和Ru為催化劑元素。柴胡注射液及其原、輔料在生產(chǎn)過程中并無使用過金屬催化劑，故無需對這幾種催化劑元素進行風險評估。

因此，選擇Pb、Cd、As、Hg、Cu、Co、Ni、V、Li、Sb、Ti、Sn、Al、Cr、Fe、Ba、Mo作為待測元素。柴胡口服液的每日最大使用量為8 mL，本品每毫升含Pb、Cd、As、Hg、Cu、Co、Ni、V、Li、Sb、Sn、Cr、Ba、Mo 分別不得超過1.5，0.375，0.75，0.25，18.75，0.625，2.5，1.25，31.25，75，11.25，137.5，87.5，1.25 μg 。10批供試品中上述元素含量均低于規(guī)定值。Al、Fe、Ti 3種元素沒有相關(guān)規(guī)定，需要進一步研究和探索。

3.3 內(nèi)標元素的選擇

采用ICP-MS 法檢測多元素時存在明顯的基體效應(yīng)?；w干擾主要表現(xiàn)在樣品基體檢測過程中對檢測元素信號產(chǎn)生抑制或增強效應(yīng)，產(chǎn)生短期或長期漂移。通過加入與待測元素物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)和質(zhì)量數(shù)相近的內(nèi)標元素，可以監(jiān)測和校正信號的短期和長期漂移，提高儀器的穩(wěn)定性，改善測定的精密度，消除基體干擾。根據(jù)內(nèi)標同位素質(zhì)量數(shù)與待測元素質(zhì)量數(shù)相近的原則，本研究選取了Sc、Ge、In和Bi作為內(nèi)標元素。

3.4 檢測條件的優(yōu)化

由于柴胡注射液中含有氯化鈉，氯元素與氬氣結(jié)合會產(chǎn)生40ArCl，將干擾75As的測定，導(dǎo)致結(jié)果偏高，故本實驗采用KED模式。

用質(zhì)譜調(diào)諧溶液優(yōu)化儀器工作條件，可使儀器靈敏度、氧化物、雙電荷等各項指標達到測定要求。

綜上所述，本試驗建立了ICP-MS法同時測定柴胡注射液中18種元素的含量，方法靈敏度高，重復(fù)性好，測定迅速，結(jié)果準確，能極大地提高檢測效率和準確度，不僅為柴胡注射液質(zhì)量標準的完善和安全用藥提供了科學(xué)依據(jù)，也為中藥注射劑的質(zhì)量控制和合理應(yīng)用提供了有益參考。