重組醇脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建

焦學(xué)詩瑪，周文煊，陳文欣，尹龍飛

（臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000）

0 引言

目前，全球心血管病發(fā)病率逐年上升，每年死于心血管疾病的人數(shù)不斷增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2030年，全球?qū)⒂?300萬人死于心血管疾病。據(jù)統(tǒng)計，2011年，全球心血管病藥物市場規(guī)模超過1 000億美元，市場規(guī)模僅次于抗腫瘤的治療類藥物，其中降血脂藥物市場規(guī)模達370億美元，占據(jù)心血管病藥物市場規(guī)模的1/3［1］。他汀類藥物，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，是目前應(yīng)用最廣泛、效果最理想的降脂藥物。其中的明星藥物立普妥（阿托伐他汀鈣）更是創(chuàng)下了累計銷售額達到約 1500億美元的銷售神話［2］。

他汀類藥物除在母核上有較大修正，其側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本保持不變，即（3R，5S）-二羥基酯結(jié)構(gòu)，此側(cè)鏈一般都是通過合成（4R-cis）-6-甲醛基-2，2-二甲基-1，3-二氧六環(huán)-4-乙酸叔丁酯（以下簡稱D7）形成。他汀類藥物的母核的合成方法已經(jīng)基本成熟，所以合成關(guān)鍵就在于側(cè)鏈的構(gòu)建，其中對側(cè)鏈醛的碳鏈構(gòu)建及兩個手性中心建立的研究探索很多。國內(nèi)外研究表明，目前構(gòu)建手性碳中心的策略方法較多，主要可分為：手性輔助劑法［3-4］、手性池法［5］、不對稱催化法、手性拆分法。但是這些路線使用劇毒物氰化鈉和極易自燃且價格昂貴的二乙基甲氧基硼，存在高成本、高耗能、高排放的缺點。此外各國研究人員都在研究用生物催化的方法來替代化學(xué)合成過程中的某些關(guān)鍵步驟，從而降低排放且環(huán)境友好［6-9］。他汀側(cè)鏈合成的最后一步目前采用CoCl2催化（4R-cis）-6-羥甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六環(huán)-4-乙酸叔丁酯（簡稱D6）合成D7方法，如圖1所示，但是它存在利用化學(xué)法合成的各種缺點。

醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH，EC 1.1.1.1）是一種以NADH或NADPH為輔因子，催化醇和醛/酮之間雙向可逆的氧化還原反應(yīng)，催化反應(yīng)以NAD（H）或NADP（H）為輔酶。當(dāng)?shù)孜餅檫€原態(tài)物質(zhì)，輔酶是氧化態(tài)時，醇脫氫酶催化氧化反應(yīng)為主；而相反條件下醇脫氫酶則催化還原反應(yīng)為主，利用醇脫氫酶在催化醇和醛/酮之間的氧化還原反應(yīng)的研究報道較多［10-11］。特別是醇脫氫酶是作為氧化還原酶中一類重要的手性合成催化劑，醇脫氫酶由于立體選擇性高、對底物的適應(yīng)性較廣已經(jīng)在手性化合物的制備中得到廣泛應(yīng)用［12-14］。

圖1 從D6到D7的化學(xué)催化合成

本研究將對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）醇脫氫酶基因進行克隆，并將其導(dǎo)入到大腸桿菌中，構(gòu)建重組脫氫酶基因工程菌，為用生物催化法合成他汀類藥物的手性側(cè)鏈奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

S.cerevisiae、用于質(zhì)粒的擴增與目的基因克隆的大腸桿菌DH5α（Escherichia coliDH5α）、用于目的基因的表達的大腸桿菌BL21（E.coliBL21）、表達載體的pET-28b（+）均為實驗室保藏，質(zhì)粒pMD18-T購買于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 實驗試劑

TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、Nco I、Xho I、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marker，蛋白質(zhì)Marker均購買于北京鼎國昌盛有限公司；氨芐青霉素、卡那青霉素、瓊脂糖、核酸染料DNA green、酵母浸出粉、蛋白胨均購買于上海生物工程有限公司；胰蛋白胨、瓊脂、酵母提取物均購買于Oxoid公司。

1.1.3 實驗器材

A300 PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），JY300電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），WD-9413C凝膠成像系統(tǒng)（北京六一儀器廠），VCX130PB/VX130超聲破碎儀（美國Sonic公司），SX-500高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY公司）。

1.1.4 引物設(shè)計與合成

依據(jù)S.cerevisiae的醇脫氫酶基因序列（NM_001180183.1）使用primer premier設(shè)計引物，分別在引物5'端添加酶切位點以保護堿基，由上海生工合成。

UP5'GCCCATGGATGGGTTCTTTCCACCAGCAA 3'（Nco I）

DW 5'GACTCGAGAACTTTCTGCGCGGCGTAGTTG 3'（Xho I）

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

運用 Clustal W 軟件對S.cerevisiaeS288C，S.cerevisiaeYJM1342，Zygosaccharomyces bailiiISA1307，Kluyveromyces marxianus的氨基酸序列進行對比。本研究涉及的基因序列與氨基酸序列，來自美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2.2 釀酒酵母脫氫酶目的基因的克隆與回收

（1）PCR反應(yīng)體系為50μL，其中上下游引物各2μL（0.5μmol/L），基因組DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶 1μL，dNTP 4 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 補足至 50 μL。

（2）反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸70 s，循環(huán)32次；72℃延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒根據(jù)說明書回收PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物與T載體的連接及轉(zhuǎn)化

（1）總連接體系為 10 μL，其中 1.0 μL T4 DNA Ligase，1.5μL質(zhì)粒 pMD18-T，1.0 μL T4 DNA Ligase Reaction Buffer，1.5 μL PCR 產(chǎn)物，5.0 μL ddH2O。

（2）16℃中連接10 h，在PCR儀里進行，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化按照分子克隆操作［15］。

1.2.4 重組質(zhì)粒pMD18-T-S288C的提取與酶切鑒定

挑選單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒抽提試劑盒按照說明書提取重組質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶Nco I、Xho I進行雙酶切，電泳檢測酶切結(jié)果。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET-28b-S288C的連接及轉(zhuǎn)化

（1）用限制性內(nèi)切酶Nco I、Xho I對pET-28b載體進行酶切。

（2）用T4 DNA連接酶將pET-28b載體和質(zhì)粒pMD18-T-S288C的酶切產(chǎn)物相連接，獲得新的重組質(zhì)粒pET-28b-S288C。

（3）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21，在LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫下，200 rpm/min培養(yǎng)30 min；涂板于含卡那霉素的LB平板上，然后挑取單菌落37℃培養(yǎng)過夜，再抽質(zhì)粒并酶切電泳鑒定。

1.2.6 重組質(zhì)粒pET-28b-S288C的提取與酶切鑒定

挑選單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶Nco I、Xho I進行雙酶切，電泳檢測酶切結(jié)果。

1.2.7 SDS-PAGE鑒定

接1 ml新鮮菌液至50 ml LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD=0.6-0.8，加0.5 mM IPTG在25℃下誘導(dǎo)16 h，取誘導(dǎo)后的菌液，4℃8000 rpm/min離心5 min收集菌體，用PBS緩沖液清洗2次，再用超聲破碎儀破碎至菌液澄清，4℃13000 rpm/min離心10 min，取上清液和沉淀，加上樣緩沖液于沸水浴中煮沸10 min，最后用SDS-PAGE鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫氫酶氨基酸的多序列對比

運用 Clustal W 軟件將S.cerevisiaeS288C與S.cerevisiaeYJM1342、Z.bailiiISA1307、K.marxianus進行多序列對比，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeS288C的氨基酸序列與S.cerevisiaeYJM1342、Z.bailiiISA1307的氨基酸序列相似度較高，而與K.marxianus的氨基酸序列相似度較低，如圖2所示。

圖2 脫氫酶的氨基酸多序列對比

2.2 釀酒酵母脫氫酶基因的PCR擴增

以釀酒酵母基因組為模板進行PCR擴增，PCR結(jié)果如圖3所示。圖中擴增產(chǎn)物所對的DNA條帶即為目的基因大小相對應(yīng)，約939 bp。

2.3 重組質(zhì)粒pMD18-T-S288C雙酶切驗證

如圖4所示，重組質(zhì)粒pMD18-T-S288C采用限制性內(nèi)切酶Nco I、Xho I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，與DNA Marker相對比，獲得大小約939 bp和3000 bp兩條帶，分別對應(yīng)目的基因和T載體的長度大小。重組質(zhì)粒中的基因序列再以pMD18-T載體通用引物測序、對比，與目的基因序列一致。

圖3 PCR擴增產(chǎn)物

圖4 重組質(zhì)粒pMD18-T-S288C電泳驗證（M：Marker）

2.4 重組質(zhì)粒pET-28b-S288C雙酶切驗證

將重組質(zhì)粒pET-28b-S288C采用限制性內(nèi)切酶Nco I、Xho I雙酶切，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，與DNA Marker相對比，獲得大小約939 bp和5300 bp兩條帶，如圖5所示，與基因和pET28b的大小一致，表明基因已成功連接到表達質(zhì)粒pET28b上。

2.5 SDS-PAGE鑒定

菌株通過搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)，再超聲破碎后，進行SDS-PAGE分析。如圖6所示，跟①號未加誘導(dǎo)劑的空白對照相比，②、③號條帶分別是加IPTG誘導(dǎo)劑后離心得到的沉淀與上清，在35 KDa處上方有特異性蛋白質(zhì)表達，與預(yù)測的目的蛋白的分子量35.56 KDa基本一致；可知目的蛋白主要在上清液中，為可溶性表達，沒有發(fā)生變性，為后面應(yīng)用該重組蛋白去實現(xiàn)生物催化反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

圖5 重組質(zhì)粒pET-28b-S288C電泳驗證（M:Marker）

圖6 SDS-PAGE分析

3 結(jié)論

他汀類藥物除了降低膽固醇以外，還具有免疫抑制性，被作為器官移植后排斥療法的常規(guī)藥物，因此在世界范圍內(nèi)他汀類藥物需求量正在不斷擴大［16］。然而化學(xué)合成他汀類藥物手性側(cè)鏈存在著高排放、高污染、高成本等問題，生物催化法因綠色無污染且成本低而被各國學(xué)者喜愛。本文通過PCR擴增目的基因，首先連接到pMD18-T載體，待目的基因序列測序驗證正確后再連接到表達載體pET28b，最后成功構(gòu)建了重組脫氫酶基因基因工程菌株BL21-pET28b-S288C，并實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的高豐度可溶性表達。如何利用生物催化法將脫氫酶基因工程菌運用到他汀類藥物關(guān)鍵側(cè)鏈的合成以及工業(yè)生產(chǎn)中，今后仍需要進一步深入研究。