一種特異性識(shí)別半胱氨酸的熒光探針的合成及性能研究

陳彩霞，厲凱彬，韓得滿

（臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)藥化工與材料工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

0 引言

半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的三大生物硫醇，它們?cè)谏矬w內(nèi)的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1］。其中，Cys是一種含有巰基的還原性氨基酸，也是人體必需的氨基酸之一。它可以由人體內(nèi)的蛋氨酸（甲硫氨酸，人體必需氨基酸）轉(zhuǎn)化而來(lái)。Cys在蛋白質(zhì)合成，解毒，金屬結(jié)合，翻譯后修飾和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［2-3］。然而，生物體內(nèi)硫醇濃度的異?？赡軙?huì)引發(fā)多種疾病，Cys的缺乏將會(huì)導(dǎo)致兒童生長(zhǎng)緩慢、肝臟損傷、皮膚疾病等病癥［4］；血漿中Hcy的濃度過(guò)高會(huì)誘發(fā)心血管疾病、阿爾茲海默病以及骨質(zhì)疏松等疾病［5］；機(jī)體內(nèi)GSH的濃度的異常會(huì)增加白血病、癌癥以及艾滋病的發(fā)生率［6-7］。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種有效的方法來(lái)選擇性地檢測(cè)Cys、Hcy和GSH。

用于檢測(cè)巰基物質(zhì)的方法有很多，包括電化學(xué)法、高效液相色譜法（HPLC）以及毛細(xì)管電泳法（CE）等［8-9］。相比于這些，熒光探針具有結(jié)構(gòu)多樣性、合成成本低、較好的細(xì)胞膜滲透性、生物安全性、功能可設(shè)計(jì)性等優(yōu)點(diǎn)，已成為快速靈敏檢測(cè)樣品的有效方法［10-12］。最近，已開(kāi)發(fā)出大量用于生物硫醇的熒光探針，相應(yīng)的設(shè)計(jì)策略通?；诹虼蓟鶊F(tuán)的強(qiáng)親核性以及各種反應(yīng)機(jī)理，如邁克爾加成，環(huán)化，裂解反應(yīng)等［13-15］。但由于相似的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性，大多數(shù)報(bào)道的文獻(xiàn)難以區(qū)分這三種巰基氨基酸（Cys/Hcy/GSH）［16-19］。

因此，開(kāi)發(fā)用于區(qū)分Cys/Hcy/GSH的選擇性熒光探針是非常具有挑戰(zhàn)性的。本文報(bào)道了一種能特異性識(shí)別Cys的熒光探針。該探針是將N-羥乙基-4溴-1，8-萘酰亞胺與SBD-Cl通過(guò)哌嗪相連制備而成的，制備方法簡(jiǎn)單，操作容易，穩(wěn)定性較好，對(duì)Cys響應(yīng)時(shí)間較短，紫外和熒光光譜上都能表現(xiàn)出其獨(dú)特的變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)中所購(gòu)買(mǎi)的化學(xué)試劑均為分析級(jí)。相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)都在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下進(jìn)行，并不定時(shí)地使用硅膠預(yù)涂的E-Merck鋁板通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。所有的試驗(yàn)用水均為去離子水。此外，使用四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)在Bruker AM-400光譜儀上記錄1H和13C NMR光譜。使用標(biāo)準(zhǔn)條件（ESI，70eV）在Waters LCT Premier XE光譜儀上記錄高分辨率質(zhì)譜。使用梅特勒托利多FE28型pH計(jì)緩沖溶液pH值的測(cè)定。使用安捷倫Cary 60 UV-Vis分光光譜儀進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜的測(cè)定。使用Varian Cary Eclipse熒光光譜儀進(jìn)行熒光光譜的測(cè)定。

1.2 化合物1的合成

圖1 化合物1（探針）的合成路線

第一步：在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，準(zhǔn)確稱取N-羥乙基-4溴-1，8-萘酰亞胺（2.0 g，6.26 mmol），哌嗪（697 mg，8.10 mmol）置于50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL乙二醇單甲醚溶解，在100℃的條件下回流攪拌反應(yīng)10小時(shí)。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，待混合物冷卻至室溫，抽濾，所得固體先用少量乙二醇單甲醚溶液洗滌，再用石油醚沖洗，最后放入真空干燥箱內(nèi)干燥，產(chǎn)物為化合物3，直接用于第二步反應(yīng)。

第二步：在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，稱取第一步產(chǎn)物3（200 mg，0.62 mmol）置于50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL二氯甲烷溶解，向上述溶液中滴加208μL三乙胺，再用2 mL二氯甲烷溶解SBD-Cl（126 mg，0.50 mmol），并滴加到上述混合液中，25℃攪拌反應(yīng)1小時(shí)。利用薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，并用柱層析（流動(dòng)相比例：甲醇/二氯甲烷=1/20）分離提純得到最終產(chǎn)物1 124 mg，產(chǎn)率為98.4%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 8.44（d，J=8.0 Hz，1 H），8.39（d，J=8.0 Hz，1 H），8.32（d，J=8.0 Hz，1 H），8.11（d，J=8.0 Hz，1 H），7.99（d，J=8.0 Hz，1 H），7.75（t，J=8.0 Hz，1 H），7.35（d，J=8.0 Hz，1 H），4.79（t，J=2.0 Hz，1 H），4.12（t，J=8.0 Hz，2 H），3.57（q，2 H），3.53（m，4 H），3.30（m，4 H）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ 164.1，163.6，155.2，149.7，146.7，136.8，133.2，132.4，131.2，131.1，129.5，126.7，126.6，125.8，124.7，123.2，117.0，116.2，58.3，52.5，46.1，42.1;HR-ESI-MS m/z:［M+Na］+calcd.for 564.0721 found 564.0714。

1.3 光譜測(cè)試

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和PBS緩沖溶液的配制

準(zhǔn)確稱量化合物1（1.0 mg）溶于1.845 mL DMSO中，得［M］=1×10-3mol/L的探針標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用Na2HPO4、NaH2PO4配制pH=7.4的磷酸緩沖溶液備用。

1.3.2 隨時(shí)間變化紫外吸收光譜曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確移取20μL探針1標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入到1 mL PBS緩沖溶液和1 mL DMF溶液混合體系中，向其中分別加入50μM Cys，Hcy和GSH，分別測(cè)定紫外吸收光譜曲線隨時(shí)間的變化。

1.3.3 隨時(shí)間變化熒光光譜曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確移取20μL探針1標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1 mL PBS緩沖溶液和1 mL DMF溶液混合體系中，向其中各加入0-50μM Cys，測(cè)定并觀察熒光光譜曲線隨著Cys濃度的變化，激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm。

1.3.4 探針1在不同pH下對(duì)Cys的響應(yīng)測(cè)試

準(zhǔn)確移取20μL探針1標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1 mL HCl-Tris緩沖溶液（pH=2-12）和1 mL DMF溶液混合體系中，向其中各加入50μM Cys，測(cè)定并觀察探針1在不同pH下對(duì)Cys的響應(yīng)效果。

1.3.5 選擇性的測(cè)定

分別準(zhǔn)確移取20μL探針1標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1 mL PBS緩沖溶液和1 mL DMF溶液中，分別向其中加入50 μM的Cys、GSH、Hcy、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、色氨酸（Trp）、蘇氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、組氨酸（His）、甲硫氨酸（Met），放置 20 min 后分別測(cè)定在不同干擾物存在下熒光發(fā)射光譜曲線變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針1的合成表征

如圖1所示，探針1是N-羥乙基-4溴-1，8-萘酰亞胺與SBD-Cl通過(guò)哌嗪相連制備而成的，合成簡(jiǎn)便，便于放大合成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和1H NMR，13C NMR，HR-MS分析結(jié)果一致。（詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)1.2）

2.2 探針的光譜性能測(cè)試

為了研究探針的應(yīng)用價(jià)值，以2 mL PBS-DMF（v/v=1:1，pH=7.4）混合溶液為測(cè)試體系，研究了探針對(duì)Cys的檢測(cè)性能。如圖2所示，當(dāng)加入過(guò)量的Cys后，335 nm處的吸收峰消失，同時(shí)400 nm處的吸收峰增強(qiáng)，之后400 nm處的吸收峰紅移至410 nm，這表明探針1與Cys的反應(yīng)過(guò)程分兩步進(jìn)行。當(dāng)加入過(guò)量的Hcy/GSH后，只發(fā)生335 nm處吸收峰消失和400 nm處吸收峰增強(qiáng)，未出現(xiàn)光譜紅移的現(xiàn)象，說(shuō)明探針1與Hcy/GSH反應(yīng)只有一步反應(yīng)。

如圖3（a）所示為探針在不同濃度Cys（0-50μM）存在下的熒光光譜圖，熒光強(qiáng)度隨著Cys濃度的增加而增強(qiáng)，且熒光發(fā)射峰由530 nm紅移至570 nm。而當(dāng)加入Hcy/GSH 30 min，530 nm處熒光強(qiáng)度小幅度增強(qiáng)，但并沒(méi)有發(fā)生紅移的現(xiàn)象，如圖3（b）所示。pH往往是影響探針傳感性能重要條件，因此，我們探究了不同pH條件下探針1對(duì)Cys的響應(yīng)情況，如圖3（c）所示。探針1在pH=2-12的范圍內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性，且在pH=7-12范圍內(nèi)對(duì)Cys較佳的響應(yīng)效果。這表明探針1可用于在生理環(huán)境的pH范圍下對(duì)Cys的檢測(cè)。

另外，研究了探針1對(duì)Cys的選擇性，如圖3（d）所示。探針1對(duì)Cys具有很好的熒光響應(yīng)，能對(duì)Hcy/GSH產(chǎn)生一定的熒光響應(yīng)，但其不能使光譜發(fā)生紅移現(xiàn)象。另外，探針1對(duì)其他不含巰基氨基酸（Ala、Arg、Gly、Trp、Thr、Phe、Leu、Ser、Pro、His、Met）不產(chǎn)生熒光響應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針1對(duì)Cys具有優(yōu)良的選擇性。

圖2 探針1在不同氨基酸下的紫外光譜曲線變化圖

圖3 探針1對(duì)氨基酸響應(yīng)的熒光光譜數(shù)據(jù)圖

因此，根據(jù)以上紫外熒光光譜性能數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)［11］和［13］中報(bào)道的有關(guān)硫醇響應(yīng)探針的反應(yīng)機(jī)理，我們推測(cè)探針1響應(yīng)硫醇的反應(yīng)機(jī)理如圖4所示。探針1與Cys發(fā)生兩步反應(yīng)，Cys分子內(nèi)的巰基先取代探針?lè)肿又械穆仍?，隨后發(fā)生一步分子內(nèi)重排反應(yīng)，氨基進(jìn)一步取代硫原子；由于Hcy/GSH分子內(nèi)的氨基距離巰基較遠(yuǎn)，無(wú)法發(fā)生重排反應(yīng)。

圖4 探針1與Cys和Hcy/GSH的反應(yīng)機(jī)制

3 結(jié)論

本文通過(guò)兩步常規(guī)反應(yīng)，將N-羥乙基-4溴-1，8-萘酰亞胺與SBD-Cl通過(guò)哌嗪相連制備得到一種能夠用于選擇性檢測(cè)Cys的熒光探針化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與1H NMR、13C NMR、HR-MS分析結(jié)果一致。該探針合成方法簡(jiǎn)單，光譜性能穩(wěn)定性較好，可以快速、靈敏地與Cys響應(yīng)，紫外光譜曲線發(fā)生比率型變化，熒光光譜曲線增強(qiáng)同時(shí)伴有30 nm的紅移。該研究結(jié)果為發(fā)展新型硫醇類熒光探針提供了思路。