銀耳多糖的抗光老化作用初探

于玲

（福建省輕工業(yè)研究所有限公司，福建 福州 350005）

皮膚是人體最大的器官，有著保護(hù)、調(diào)節(jié)、感覺等功能，但其長期暴露在具有各種危險(xiǎn)因素，如紫外線（UV）、化學(xué)物等[1,2]的環(huán)境中。UV的照射可導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生一系列毒性效應(yīng)，包括紅斑、水腫、脫屑、皮膚炎癥、光老化以及光致癌[3-5]，這與活性氧簇（ROS）、氧化應(yīng)激及DNA、脂質(zhì)、蛋白等氧化損傷相關(guān)。UVB（波長280～320 nm）可造成細(xì)胞DNA損傷，生成嘧啶二聚體損傷表皮細(xì)胞，是人類皮膚癌的主要致癌物[6,7]，因此，為減緩皮膚光老化尋找合適的抗光老化產(chǎn)品日益受到重視。

近期，多種自然化合物正作為抗氧化劑備受關(guān)注。銀耳是一種藥食兼用真菌，含有豐富的多糖、維生素、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[8,9]。銀耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharides，TFPS）是銀耳中最主要的功效活性成分，具有補(bǔ)水保濕、抗氧化、美容麗膚等功效[8]，銀耳多糖（TFPS）在調(diào)節(jié)UVB誘導(dǎo)的皮膚表皮損傷的作用仍有待研究。本文探索了銀耳多糖（TFPS）對UVB照射后人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）的抗光老化作用，旨在為銀耳多糖（TFPS）在具有抗光老化活性的功能護(hù)膚品或修復(fù)皮膚光損傷治療藥物方面的應(yīng)用提供經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：銀耳多糖（福建省輕工業(yè)研究所中間試驗(yàn)工廠）；HaCaT細(xì)胞（廣州艾迪基因科技有限責(zé)任公司）；CCK-8試劑盒、0.4%臺盼藍(lán)染液（碧云天生物）。

儀器與設(shè)備：紫外交聯(lián)儀（UV07-II，南京寧凱儀器有限公司）；倒置顯微鏡（CKX53，Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)以及UV照射

采用完全培養(yǎng)基（含10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清以及終濃度為1 μmol/L 青霉素、鏈霉素DMEM培養(yǎng)基），將處于生長指數(shù)期的HaCaT細(xì)胞接種在不同規(guī)格的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度37 ℃，二氧化碳濃度5%。

用緩沖溶液PBS（濃度 0.01 mol/L，pH值為7.4）清洗培養(yǎng)細(xì)胞。UVB（280～320 nm）輻照強(qiáng)度控制為0.60 mW/cm2、照射距離20 cm，輻照計(jì)測定距離為UVB燈管20 cm處，根據(jù)公式⑴確定輻照時(shí)間。

1.2.2 細(xì)胞活力測定

不同濃度TFPS對HaCaT細(xì)胞活力的影響：將細(xì)胞接種在96孔板中（1×104細(xì)胞/孔），每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，在 37 ℃、5%二氧化碳濃度的條件下培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，使用含相應(yīng)終濃度為0、1、2、3、4、5 mg/mL的TFPS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，根據(jù) CCK-8試劑盒的說明書，向每孔加入110μL CCK工作溶液（100μL PBS+10μL CCK溶液），靜置培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育45 min，使用酶標(biāo)儀測定在波長450 nm處的吸光度，根據(jù)公式⑵計(jì)算細(xì)胞活力。

不同濃度銀耳多糖（TFPS）對 UVB照射后HaCaT細(xì)胞活力的影響：細(xì)胞分為0、5、10、20、30 mJ組，將細(xì)胞接種在96孔板中（1×104細(xì)胞/孔），在37 ℃、5%二氧化碳濃度的條件下培養(yǎng)48 h，移除培養(yǎng)基后每孔加入100μL的PBS，用相應(yīng)劑量UVB照射，然后使用含終濃度5 mg/mL的TFPS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同法進(jìn)行CCK-8檢測，計(jì)算細(xì)胞活力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇特定UVB劑量，照射同法培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，使用終濃度分別為0、1、2、3、4、5 mg/mL的TFPS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同法計(jì)算細(xì)胞活力。

將細(xì)胞接種在六孔板中（3×105細(xì)胞/孔），在37 ℃、5%二氧化碳濃度的條件下培養(yǎng)48 h，移除培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，每孔加入200μl的PBS后接受UVB照射。使用含相應(yīng)終濃度TFPS（0、1、2、3、4、5 mg/mL）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，加入0.04%臺盼藍(lán)工作液（PBS∶0.4%臺盼藍(lán)=9∶1），每孔300μL，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況，計(jì)數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析使用Image J、PowerPoint、Graphpad Prism 5.0、Photoshop和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析以及制圖。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA 和ttest分析），P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度TFPS對HaCaT細(xì)胞活力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度TFPS對HaCaT細(xì)胞均無毒害作用，且可促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.05）（圖1），因此，選擇5 mg/mL濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度TFPS對HaCaT細(xì)胞活力的影響

2.2 TFPS 對HaCaT細(xì)胞受不同劑量UVB照射后的細(xì)胞活力影響

HaCaT 細(xì)胞在接受5、10、20、30 mJ/cm2的UVB照射后，細(xì)胞活力均明顯下降，細(xì)胞固縮，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)5 mg/mL的TFPS處理后，除30 mJ/cm2劑量照射組外，細(xì)胞活力較對照組均明顯增加（P<0.05）（圖2）；臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞數(shù)較空白組明顯減少（p<0.001），固縮細(xì)胞減少（圖3），故選擇20 mJ/cm2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 5 mg/mLTFPS對不同劑量UVB照射后HaCaT細(xì)胞活力的影響

圖3 臺盼藍(lán)染色結(jié)果

2.3 不同濃度TFPS（0、1、2、3、4、5 mg/mL）對UVB照射HaCaT細(xì)胞活力的影響

HaCaT 細(xì)胞在接受20 mJ/cm2UVB照射后，細(xì)胞活力均明顯下降，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)1、2、3、4、5 mg/mL濃度的TFPS處理后，細(xì)胞活力較空白組均明顯增加（P<0.05），且臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞數(shù)較空白組明顯減少（p<0.001）。

本研究的多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀耳多糖安全無毒，可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，有效提高UVB照射后HaCaT細(xì)胞活力。

圖4 不同濃度TFPS對UVB照射后HaCaT細(xì)胞活力的影響

3 結(jié)論

研究顯示銀耳多糖（TFPS）預(yù)處理可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化物質(zhì)活性顯著增加，還可以通過上調(diào)Nrf2和下調(diào) Keap1表達(dá)保護(hù)人真皮成纖維細(xì)胞[10]。TFPS可通過抑制蛋白激酶B、p38絲裂原活化蛋白激酶、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的激活來降低脂多糖處理的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平，還可以顯著抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[11,12]。

本研究結(jié)果顯示，1～5 mg/mL的銀耳多糖（TFPS）安全性好，可提高HaCaT細(xì)胞被UVB照射后降低的細(xì)胞活力，研究結(jié)果表明銀耳多糖（TFPS）能夠促進(jìn)起到抗光損傷的作用，推測可能與抗氧化作用相關(guān)，具體仍有待后續(xù)研究。本研究結(jié)果為TFPS在具有抗光老化活性的功能護(hù)膚品或修復(fù)皮膚光損傷治療藥物方面的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。