麝香通心滴丸對高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能及Rho/ROCK信號通路的影響

李立杰，葛華 ，陳曦，魯偉，王月，陳克研

（1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110024；2.中國醫(yī)科大學實驗動物部，沈陽 110122）

內(nèi)皮細胞主要以旁分泌的形式分泌血管內(nèi)皮衍生舒張因子 （endothelium derived relaxing factor，EDRF） 和內(nèi)皮源血管收縮因子 （endothelium derived contracting factor，EDCF），兩者共同調(diào)節(jié)血管張力。正常情況下，EDRF與EDCF處于平衡狀態(tài)，但是在高血壓病理情況下，血管壓力增加，打破了EDRF與EDCF的平衡，造成內(nèi)皮細胞形態(tài)結(jié)構改變和功能的失調(diào)，加速高血壓的發(fā)生與發(fā)展，因此，血管內(nèi)皮損傷既是高血壓的病理結(jié)果，也是高血壓的致病因素［1-2］。近年來減輕血管內(nèi)皮損傷，改善血管內(nèi)皮功能已經(jīng)成為治療高血壓的研究熱點［3］。麝香通心滴丸是目前國內(nèi)應用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心?。?治療的中藥復方藥物，由麝香、人參、莖葉總皂苷、蟾酥、丹參、熊膽粉、人工牛黃及冰片組成，具有芳香益氣通脈，活血化瘀止痛之效［4-5］。臨床研究［6］表明，麝香通心滴丸具有保護血管內(nèi)皮作用，但具體分子機制尚不明確。

RhoA/ROCK信號通路是心血管系統(tǒng)領域的熱點通路，RhoA GTP酶及其下游ROCK與血管平滑肌收縮、應力纖維形成、細胞遷移及血壓調(diào)節(jié)等過程有關［7］。因此，RhoA/ROCK信號通路對高血壓、動脈粥樣硬化及中風等心血管系統(tǒng)疾病具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究建立高血壓大鼠模型，給予麝香通心滴丸干預治療，探討麝香通心滴丸對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠20只及同類正常血壓大鼠10只，體質(zhì)量200～220 g，購自上海高血壓病研究所實驗動物中心。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，濕度50%，每天光照12 h。適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將自發(fā)性高血壓大鼠分為模型組 （SHR組） 及麝香通心滴丸組 （STX組），每組10只；正常血壓大鼠作為對照組。

1.2 麝香通心滴丸劑量和配制方法

根據(jù)人體與動物藥物等效劑量換算公式［8］：B種動物的劑量 （g）=A種動物劑量 （g/kg）×W （折算系數(shù)）×B種動物的體質(zhì)量 （kg）。人與大鼠的折算系數(shù)為6。因此，麝香通心滴丸的大鼠給藥劑量約為4.2 mg/kg，將麝香通心滴丸利用無菌蒸餾水配制成420 mg/mL藥液，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)治療2周，每周測量1次體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量，對照組和SHR組給予等體積蒸餾水。

1.3 大鼠收縮壓測定

分別于給藥前，給藥1周、2周后，進行大鼠尾動脈血壓測量，在恒溫安靜的環(huán)境下，上午8：00至12：00進行大鼠動脈血壓測量，每次每只大鼠重復測量3次，血壓以波動不超過10 mmHg為宜，取3次平均值。

1.4 動物處死及取材

給藥2周后大鼠禁食12 h，然后戊巴比妥鈉（50 mg/kg） 腹腔注射麻醉，于腹主動脈采血8 mL，10 000 r/min離心10 min分離血清，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?%多聚甲醛灌注血管，隨后生理鹽水沖洗5 min，暴露胸主動脈，每只大鼠取胸主動脈 （約4.0 cm），液氮冷凍后置于-80 ℃深凍冰箱保存。

1.5 血管組織一氧化氮（nitric oxide，NO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide diasmutase，SOD）活性測定

分別采用硝酸還原酶法測定各組大鼠血管內(nèi)皮NO含量、TBA法測定大鼠血管內(nèi)皮MDA含量、采用羥胺法測定大鼠血管內(nèi)皮SOD活性 （南京建成生物技術有限公司）。將各組大鼠胸主動脈，用1 mL預冷的PBS緩沖液勻漿，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，吸取上清液至新的離心管中，采用考馬斯亮藍檢測組織勻漿液中蛋白含量。大鼠胸主動脈NO、MDA含量及SOD活性檢測實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 大鼠血清中內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelil growth factor，VEGF）含量測定

酶聯(lián)免疫吸附實驗 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 檢測各組大鼠血清中ET-1及VEGF含量，步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度值，根據(jù)梯度濃度標準品的OD值繪制標準曲線，得到回歸方程，根據(jù)回歸方程計算樣品中ET-1及VEGF含量。

1.7 血管組織 ET-1及VEGF mRNA表達測定

利用TRIzol法提取組織中總RNA，取各組大鼠胸主動脈加入1 mL TRIzol進行勻漿，勻漿液置于1.5 mL 離心管中備用；每管加入0.2 mL 氯仿，蓋緊蓋子后劇烈震搖15 s，冰浴5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；取上層水相，加入0.5 mL 異丙醇，輕輕顛倒，冰浴10 min。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL用DEPC處理的水配置的75%乙醇，洗滌沉淀。4 ℃ 7 500 r/min離心5 min；棄上清，自然吹干后用0.01% DEPC溶解沉淀，待用。按照試劑盒說明書合成cDNA。取2 μL cDNA為模板，按照實時 PCR說明書進行體外擴增，以β-actin作為內(nèi)參，引物序列如下：β-actin，上游5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’；ET-1，上游5’-AGGCGATCAGAGCAACCAG -3’，下游5’-CCA TCAAGGAGGAGCAGGA-3’；VEGF，上游5’-ACGTC GGAGAGCAACGTCAC-3’，下 游5’-ACCGGGATTTC TTGCGCTTTCGT-3’。結(jié)果使用2-△△Ct法計算基因相對表達變化。反應體系50 μL，反應條件如下：在95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)30次；72 ℃ 1 min。

1.8 Western blotting檢測

將大鼠胸主動脈剪碎，提取總蛋白，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，進行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，TBST洗膜，分別加入RhoA、ROCK、MLC及β-actin一抗（1 ∶1 000），TBST洗膜加入相應HRP標記二抗稀釋濃度為1 ∶1 000，室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件計算灰度值，采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 麝香通心滴丸對大鼠收縮壓的影響

在給予麝香通心滴丸治療前，SHR組及STX組大鼠收縮壓與對照組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05），而SHR組與STX組大鼠收縮壓差異沒有統(tǒng)計學意義 （P＞ 0.05） ；在給藥1周及2周后結(jié)果顯示，與SHR組比較，STX組大鼠尾動脈收縮壓明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05），見表1。

2.2 麝香通心滴丸對大鼠血管組織NO、MDA含量及SOD活性的影響

表1 各組大鼠不同時期收縮壓比較 （mmHg）Tab.1 Changes in systolic blood pressure at different time points in each group （mmHg）

與對照組比較，SHR組大鼠血管組織中NO含量及SOD活性明顯降低，而MDA含量卻顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義 （均P＜ 0.05） ；給予麝香通心滴丸治療后，與SHR組比較，STX組大鼠血管組織中NO含量及SOD活性明顯增加，而MDA含量顯著降低 （均P＜0.05），見表2。麝香通心滴丸能夠明顯增加高血壓大鼠血管內(nèi)皮NO含量并減輕氧化應激水平。

2.3 麝香通心滴丸對大鼠血清中ET-1及VEGF含量的影響

如表3所示，與對照組比較，SHR組大鼠血清中ET-1及VEGF含量明顯升高 （P＜ 0.05） ；給予麝香通心滴丸治療后，與SHR組比較，STX組大鼠血清中ET-1及VEGF含量顯著降低 （P＜ 0.05）。麝香通心滴丸能夠調(diào)節(jié)高血壓大鼠體內(nèi)血管活性物質(zhì)的水平。

表2 各組大鼠血管組織中NO、MDA含量及SOD活性比較Tab.2 Comparison of NO，MDA content，and SOD activity in the vascular tissues of rats in each group

表3 各組大鼠血清中ET-1、VEGF含量及血管組織中ET-1、VEGF mRNA表達比較Tab.3 Comparison of ET-1 and VEGF levels in serum，as well as those of ET-1 and VEGF mRNA expression in the vascular tissues of rats in each group

2.4 麝香通心滴丸對大鼠血管組織中ET-1及VEGF mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠血管組織中ET-1及VEGFmRNA明顯升高 （P＜ 0.05） ；給予麝香通心滴丸治療后，與SHR組比較，大鼠血管組織中ET-1及VEGFmRNA顯著降低 （均P＜ 0.05），見表3，與血清ELISA結(jié)果一致。

2.5 麝香通心滴丸對大鼠血管組織RhoA/ROCK信號通路的影響

結(jié)果顯示，與對照組比較，SHR組大鼠RhoA、ROCK及MLC蛋白表達量明顯升高 （均P＜ 0.05） ；給予麝香通心滴丸治療后，與SHR組比較，STX組大鼠血管組織中RhoA、ROCK及MLC蛋白表達明顯降低 （均P＜ 0.05），見圖1、表4。麝香通心滴丸發(fā)揮對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的保護作用，可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關。

圖1 各組大鼠RhoA、ROCK及MLC蛋白表達Fig.1 RhoA，ROCK，and MLC protein expression in each group

3 討論

血管內(nèi)皮細胞是循環(huán)血液與血管內(nèi)皮組織之間的單層細胞，是機體血液與組織之間的代謝交換屏障，也是機體分泌多種活性物質(zhì)的內(nèi)分泌腺，具有調(diào)節(jié)血管收縮及舒張的能力。血管內(nèi)皮是調(diào)節(jié)血管張力、細胞生長以及白細胞、血小板和血管壁之間相互作用的組織，血管內(nèi)皮功能不良與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關［9］。內(nèi)皮功能障礙可增加全身血管阻力，從而導致高血壓的發(fā)展［10］。中醫(yī)藥治療血管性病變主要以活血化瘀為主，降脂、抗凝，從而起到調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能的作用。麝香通心滴丸主要成分麝香具有抗血栓、抗血小板聚集的作用，并能抑制心肌耗氧量，對冠心病患者的血管內(nèi)皮具有一定的保護作用；人參主要成分人參皂苷具有較強的抗氧化作用，對心肌缺血再灌注損傷、肝損傷及高血壓、高血脂等大鼠模型均能夠發(fā)揮清除氧自由基、抑制氧化應激的作用；蟾酥具有調(diào)節(jié)血壓、擴張冠狀動脈作用，同時還能夠抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫；丹參及熊膽粉具有降脂溶栓的作用［11-12］。因此，麝香通心滴丸能夠多方面糾正血管內(nèi)皮功能紊亂，保護血管內(nèi)皮功能。

表4 各組大鼠RhoA、ROCK及MLC蛋白表達比較Tab.4 Comparison of RhoA，ROCK，and MLC protein expression in rats in each group

NO在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病機制及治療中具有重要作用，NO能抑制血小板的聚集，防止血栓形成，抑制炎癥浸潤，增強免疫調(diào)節(jié)，降低血壓和調(diào)節(jié)血管張力［13］。NO通過激活鳥苷酸環(huán)化酶以增加環(huán)磷酸鳥苷水平，環(huán)磷酸鳥苷能減少大量鈣依賴性細胞內(nèi)鈣的含量，從而抑制鈣介導的磷酸化，達到擴張血管目的。NO還能夠通過調(diào)節(jié)血管張力抑制血管緊張素Ⅱ?qū)」躈a+的重吸收，影響胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷對腎臟水鈉鹽濾過、重吸收，從而調(diào)節(jié)血壓［14］。在病理狀態(tài)下，NO釋放受到抑制，造成血管舒張功能障礙或血管內(nèi)皮收縮因子生成增加，導致血壓升高，血壓升高加重對內(nèi)皮細胞的損害，進一步抑制NO的釋放，造成惡性循環(huán)［15］。本研究STX組給予麝香通心滴丸后大鼠體內(nèi)NO水平明顯增加，說明其具有逆轉(zhuǎn)高血壓造成的NO合成及釋放量降低的作用。

ET-1是由血管內(nèi)皮分泌的細胞因子，具有強烈的縮血管作用。ET-1與NO是相互制約的血管活性物質(zhì)，NO水平降低，ET-1水平則會增加，造成血管收縮。ET-1還能夠通過激活鈣通道，增加鈣內(nèi)流，促進血管平滑肌收縮和增生，增加外周血管阻力，引起血壓升高［16］。VEGF是重要的促進血管生成的細胞因子。有研究［17］表明，高血壓發(fā)生后VEGF表達升高，進而抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡促進增殖，導致血管通透性增加，可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。本研究發(fā)現(xiàn)麝香通心滴丸治療后，大鼠血清中ET-1及VEGF含量及胸主動脈ET-1及VEGFmRNA的表達明顯降低，發(fā)揮了對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的保護作用。

研究［18］顯示高血壓可導致機體SOD活性降低及MDA含量增加，從而發(fā)生氧化應激反應，導致血管內(nèi)皮細胞功能受損。本研究中，高血壓大鼠血管內(nèi)皮中SOD活性明顯降低，而MDA含量明顯增加（均P＜ 0.05） ；麝香通心滴丸治療能夠增加SOD活性，降低MDA含量，改善高血壓大鼠氧化應激水平，從而改善血管內(nèi)皮損傷。

有研究［6，19］表明，RhoA/ROCK信號通路參與高血壓的發(fā)生與發(fā)展，在不同高血壓大鼠模型血管內(nèi)皮中均可以檢測出RhoA、ROCK的大量激活。給予ROCK抑制劑可不同程度降低血壓，因此推測RhoA/ROCK信號通路有可能成為高血壓治療的有效靶點［20］。RhoA是Rho GTP酶家族中研究最廣泛的成員之一，RhoA介導應力纖維的形成。ROCK為Rho激酶，是RhoA最直接的下游靶基因，具有調(diào)節(jié)細胞收縮、遷移和增殖等多種功能。血管內(nèi)皮收縮與舒張的平衡對于維持血壓穩(wěn)定至關重要，RhoA/ROCK信號通路可以誘導機體對鈣離子的敏感性增加，抑制MLC蛋白活性導致血管內(nèi)皮收縮；同時，RhoA/ROCK信號通路激活后還能夠促進MLC磷酸化，誘導血管內(nèi)皮收縮，使血壓升高［21-22］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麝香通心滴丸可以抑制高血壓大鼠血管組織中RhoA、ROCK及MLC蛋白的表達，從而抑制RhoA/ROCK信號通路活性，抑制血管收縮，降低血管通透性，改善高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷。

綜上所述，麝香通心滴丸能夠增加高血壓大鼠NO合成及釋放，抑制血管活性物質(zhì)ET-1及VEGF的含量，改善氧化應激，發(fā)揮降壓和保護血管內(nèi)皮的作用，其機制可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關。