CRIM1基因?qū)ξ赴┘毎鲋澈偷蛲龅挠绊懠捌漕A(yù)后價值

吳昆哲，戴冬秋

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院胃腸外科，沈陽 110032）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤發(fā)病率中居第2位，死亡率中居第3位，且在新發(fā)病例中超過90%為中晚期胃癌［1］。盡管近年胃癌手術(shù)和藥物治療的效果有了很大的提升，但是胃癌極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且晚期胃癌患者預(yù)后較差［2］。據(jù)報道，胃癌患者的5年生存率較低，2010年至2014年我國胃癌患者5年生存率僅為35.9%，較2000年至2004年的30.2%并未明顯改善，這嚴重地危害了胃癌患者的生命健康［3］。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個十分復(fù)雜的過程，受多種因素的調(diào)控，如促癌基因激活或抑癌基因失活均可導致胃癌細胞惡性增殖。因此，探索新的胃癌相關(guān)基因，對胃癌的治療和預(yù)后具有重要意義。

富含半胱氨酸型運動神經(jīng)元蛋白1 （cysteinerich motor neuron 1，CRIM1）是一類糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，可以調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （bone morphogenetic protein，BMP） 的表達。相關(guān)研究［4］表明，CRIM1在腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用，CRIM1過表達可以促進腫瘤細胞增殖并延長腫瘤細胞周期。目前，CRIM1在胃癌中的作用仍未有報道。因此，本研究旨在通過沉默CRIM1基因探討其對胃癌細胞增殖、凋亡的影響，為胃癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞系A(chǔ)GS購自中科院上海細胞庫；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；MTT購自美國Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；兔抗人GAPDH抗體、CRIM1抗體、BCL-2抗體、BAX抗體均購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自博奧森生物公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析：基因表達譜交互式分析網(wǎng)站（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一個基于癌癥基因組圖譜 （cancer genome atlas，TCGA） 和基因型－組織表達項目 （the genotype-tissue expression project，GTEx） 中的數(shù)據(jù)，用于分析RNA測序的交互式Web服務(wù)器［5］。利用GEPIA網(wǎng)站中TCGA數(shù)據(jù)分析CRIM1基因在胃癌組織 （408例） 和癌旁正常組織 （36例） 中的表達水平。利用生物數(shù)據(jù)軟件Kaplan-Meier plotter （http：//kmplot.com/analysis/） 的胃癌數(shù)據(jù)集，分析CRIM1表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。篩選條件：（1） mRNA RNA-seq：gastric cancer；（2） Probe set options：all probe sets per gene；（3） Gene symbol：CRIM1，其他選項按默認設(shè)置，共納入876例患者數(shù)據(jù)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：人胃癌細胞AGS購自中科院上海細胞庫，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于含5% CO2、恒溫37 ℃的細胞孵育箱中。每1～2 d更換1次培養(yǎng)液，并按1 ∶2的比例每2～3 d傳代1次。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d將1×106個AGS細胞接種于6孔板中，置于37 ℃的細胞孵育箱中培養(yǎng)24 h后，使用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），沉默CRIM1基因表達，所用siRNA片段由上海吉瑪公司設(shè)計合成。轉(zhuǎn)染分為3組：空白對照組、陰性對照組 （si-NC組） 和陽性轉(zhuǎn)染組 （si-CRIM1組）。采用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效果。每組設(shè)置5個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后在細胞孵育箱中培養(yǎng)48 h，收集轉(zhuǎn)染細胞用于后續(xù)研究。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖能力：取轉(zhuǎn)染后各組AGS細胞，調(diào)整細胞濃度至3×103/mL并接種于96孔板中，置于恒溫37 ℃的細胞孵育箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去每孔中的上清液，隨后向每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測各孔在450 nm處讀數(shù)，將光密度值 （optical density，OD） 視為細胞的密度，每組至少5 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，將si-CRIM1組與si-NC組OD值的比值視為siRNA轉(zhuǎn)染后AGS細胞的增殖率。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞的凋亡率：取各組AGS細胞分別接種于6孔板中，并置于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后用PBS漂洗，用不含EDTA的胰酶消化，收集細胞，將細胞濃度調(diào)整為5×105/mL。向每孔中加入500 μL連接緩沖液使細胞重懸，隨后每孔分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶染液，常溫避光繼續(xù)孵育10 min。將樣品置于流式細胞儀上檢測細胞凋亡率，每組檢測1×105個細胞。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白表達：轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，并以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，保存于-80 ℃冰箱中，BCA法測蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDSPAGE電泳 （80～120 V），100 V轉(zhuǎn)膜1 h后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液清洗3次，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃室溫振蕩1 h，再次TBST緩沖液清洗3次。滴加ECL顯影劑，并曝光，應(yīng)用Image J軟件分析各組蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

利用GEPIA網(wǎng)站獲取CRIM1mRNA在408例胃癌組織和36例癌旁正常組織中的表達情況。結(jié)果表明，胃癌組織中CRIM1mRNA的表達水平明顯高于癌旁正常組織，見圖1A。利用生物數(shù)據(jù)軟件Kaplan-Meier plotter分析CRIM1基因表達與胃癌患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示，CRIM1基因低表達患者的生存期顯著高于CRIM1基因高表達患者，差異有統(tǒng)計學意義 （P=0.004 8），見圖1B。

圖1 CRIM1在胃癌中的表達情況以及CRIM1表達水平與胃癌患者總生存期的生存曲線Fig.1 Expression levels of CRIM1 in gastric cancer and survival curves of patients with gastric cancer

2.2 si-CRIM1沉默

si-NC組與空白對照組比較，AGS細胞中CRIM1蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異 （P＞ 0.05），而si-CRIM1組與空白對照組、si-NC組比較，AGS細胞中CRIM1蛋白相對表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義 （分別為P=0.037，P=0.042），表明胃癌細胞轉(zhuǎn)染siRNA后CRIM1基因被沉默。見圖2。

2.3 沉默CRIM1表達降低AGS細胞的增殖率

圖2 3組CRIM1蛋白的表達水平Fig.2 Expression levels of CRIM1 protein in the three groups

MTT結(jié)果表明，si-CRIM1組中AGS細胞增殖率明顯低于空白對照組、si-NC組，且96 h時si-CRIM1組與空白對照組、si-NC組比較，AGS細胞增殖能力的差異均有統(tǒng)計學意義 （分別為P=0.035，P=0.042）。見圖3。

2.4 沉默CRIM1表達促進AGS細胞的凋亡率

流式細胞儀檢測結(jié)果表明，空白對照組、si-NC組、si-CRIM1組中胃癌細胞凋亡率分別為（9.85±0.45） %、（10.74±0.73） %、（18.42±0.57） %，與空白對照組和si-NC組比較，si-CRIM1組中AGS細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05）。見圖4。

2.5 沉默CRIM1表達對AGS細胞中BCL-2、BAX蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果表明，si-CRIM1組AGS中凋亡相關(guān)蛋白BCL-2的相對表達量明顯低于空白對照組和si-NC組 （分別為P=0.041，P=0.035），而凋亡相關(guān)蛋白BAX的表達明顯高于空白對照組和si-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義（分別為P=0.025，P=0.033）。見圖5。

3 討論

胃癌是世界上第三大常見的惡性腫瘤，其死亡率在世界范圍內(nèi)的腫瘤致死率中居第5位［6］。盡管近年來胃癌的治療策略有了很大的改善，但胃癌患者的預(yù)后仍然很不樂觀，其主要原因是胃癌的迅速進展與復(fù)發(fā)［7］。胃癌細胞獲得較強的增殖能力和抗凋亡能力是導致胃癌迅速進展的主要原因。因此，找到與胃癌細胞增殖和凋亡相關(guān)的關(guān)鍵基因，可以為胃癌的靶向治療提供新的分子靶點。目前，諸多基因已被報道參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但仍未有文獻報道CRIM1基因在胃癌中的作用。因此，本研究旨在通過沉默CRIM1基因探討其在胃癌增殖和凋亡方面的作用。

圖3 沉默CRIM1后3組細胞的增殖情況Fig.3 Proliferation of AGS cells in the three groups after silencing CRIM1

圖4 沉默CRIM1后3組細胞的凋亡率Fig.4 Apoptosis rates of AGS cells in the three groups after silencing CRIM1

圖5 Western blotting 檢測CRIM1沉默后3組AGS細胞的BCL-2和 BAX蛋白水平Fig.5 BCL-2 and BAX protein levels in AGS cells in the three groups detected by Western blotting after silencing CRIM1

CRIM1基因最早被報道與神經(jīng)組織的發(fā)育有關(guān)，且在神經(jīng)細胞構(gòu)建中起著重要作用［8］。CRIM1基因位于人類第2號短臂染色體上 （2p22.2），其翻譯蛋白質(zhì)量約為114×103。CRIM1是一種跨膜蛋白，含有胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白功能和多個富半胱氨酸區(qū)域［10］。富半胱氨酸區(qū)域被認為可以與BMP特異性結(jié)合，CRIM1則可以通過富半胱氨酸區(qū)域結(jié)構(gòu)抑制BMP前蛋白向成熟蛋白的轉(zhuǎn)化［11］。近年來，BMP被報道在腫瘤細胞的增殖、凋亡和血管生成中起著重要作用［12］。CRIM1作為BMP拮抗因子，逐漸顯現(xiàn)其在腫瘤中的作用。早期研究［13-15］證明，CRIM1在腎癌、肺癌、白血病等多種惡性腫瘤中表達升高，且與腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡和患者預(yù)后顯著相關(guān)。此外，有研究［9］證實敲低CRIM1基因可以降低細胞與細胞以及細胞與基質(zhì)的連接作用，從而抑制細胞的增殖。以上研究結(jié)果表明，CRIM1基因在多種惡性腫瘤中為促癌基因，但CRIM1在胃癌中的作用尚不明確。

本研究首先使用GEPIA平臺中TCGA數(shù)據(jù)分析CRIM1基因，結(jié)果顯示，CRIM1mRNA表達水平在胃癌組織中顯著高于正常胃黏膜上皮組織。此外，利用在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier plotter分析CRIM1mRNA表達與胃癌患者總生存期的關(guān)系，結(jié)果表明，CRIM1mRNA高表達的胃癌患者總生存期較差。通過進一步實驗驗證，將沉默CRIM1的siRNA轉(zhuǎn)染至胃癌AGS細胞中，探究下調(diào)CRIM1基因表達對胃癌細胞增殖和凋亡的影響。MTT和流式細胞術(shù)結(jié)果表明，沉默CRIM1基因表達后AGS細胞的增殖率顯著降低，而凋亡率明顯升高。Western blotting 結(jié)果顯示，沉默CRIM1基因表達可以抑制AGS細胞中BCL-2蛋白的表達，同時升高BAX蛋白表達，進一步說明CRIM1基因可能調(diào)控胃癌細胞凋亡過程。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，高表達的CRIM1基因與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)，并且該基因可能通過調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)因子在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究為探究CRIM1在胃癌細胞增殖和凋亡中的作用提供了相關(guān)的實驗依據(jù)。未來將進一步深入研究CRIM1基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，從而為胃癌的基因靶向治療創(chuàng)造更多可能。