有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)人骨骼肌基因表達(dá)的影響

王子璐，劉立民，孫曉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.體育部，沈陽(yáng) 110122；2.附屬盛京醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng) 110004）

體育鍛煉的缺乏是誘發(fā)慢性病的重要原因之一［1-2］。體育活動(dòng)已被證明可以改善和調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)代謝效率［3］。年輕人和老年人久坐的生活方式和低體力活動(dòng)是健康的不良因素。雖然有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的有益作用已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，但很少有研究關(guān)注于評(píng)估有氧運(yùn)動(dòng)與機(jī)體基因表達(dá)之間的關(guān)系及其促進(jìn)健康、預(yù)防疾病的分子機(jī)制。本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)方法分別分析年輕人和老年人2個(gè)年齡段中運(yùn)動(dòng)組和非運(yùn)動(dòng)組股外側(cè)肌活檢樣本基因表達(dá)譜，旨在探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)人骨骼肌全基因組表達(dá)的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺(tái) （gene expression omnibus，GEO） 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）［4］下 載GSE9103，該數(shù)據(jù)庫(kù)為mRNA基因芯片數(shù)據(jù)集，芯片平臺(tái)是GPL570 ［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。用該芯片對(duì)股外側(cè)肌活檢樣本進(jìn)行骨骼肌轉(zhuǎn)錄譜分析，共40例樣本，其中包含10例年輕久坐者、10例老年久坐者、10例年輕訓(xùn)練者和10例老年訓(xùn)練者。

1.2 差異表達(dá)基因 （differentially expressed genes，DEGs）篩選

應(yīng)用R語(yǔ)言對(duì)芯片進(jìn)行分析，讀取下載矩陣文件，使用limma包分別對(duì)年輕久坐組和年輕訓(xùn)練組，以及老年久坐組和老年訓(xùn)練組進(jìn)行分析，直接獲取DEGs，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行去重［5］。篩選標(biāo)準(zhǔn)［4］為：log2基因表達(dá)差異倍數(shù) （fold change，F(xiàn)C） 絕對(duì)值≥1，P＜0.05。用“ggplot2”R語(yǔ)言包繪制火山圖，同時(shí)根據(jù)差異表達(dá)數(shù)據(jù)，用“VennDiagram”R語(yǔ)言包繪制韋恩圖。

1.3 DEGs的基因本體論 （gene ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書(shū) （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 分析

本研究應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID （https：//david.ncifcrf.gov/），分析提供所需的GO功能富集數(shù)據(jù)，分別按照生物途徑 （biological process，BP）、細(xì)胞定位（cellular component，CC）、分子功能 （molecularfunction，MF） 對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類。除此之外，采用KEGG分析，用以發(fā)現(xiàn)可能涉及的生物學(xué)通路［6］。使用EASE Score或Fisher Exact統(tǒng)計(jì)方法，GO和KEGG各項(xiàng)篩選條件為P＜ 0.05［7］。應(yīng)用“ggplot2”R語(yǔ)言包根據(jù)分析結(jié)果繪制氣泡圖。

1.4 DEGs的蛋白質(zhì)相互作用 （protein-protein interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

STRING （https：//string-db.org/） 是一款在線分析工具 （當(dāng)前版本11.0），用來(lái)呈現(xiàn)與評(píng)估PPI網(wǎng)絡(luò)［8］。將本研究篩選出的所有DEGs導(dǎo)入STRING，通過(guò)STRING分析工具可以進(jìn)一步探尋這些DEGs之間潛在的聯(lián)系［9］。篩選條件設(shè)置為：置信度≥0.15，互作最大值=0。之后把STRING的計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape （版本3.7.1）［10］，挖掘PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最為緊密的集簇［5］，應(yīng)用的是分子復(fù)合物檢測(cè) （molecular complex detection，MCODE） 插件，篩選設(shè)置參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)。此外應(yīng)用cytoHubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的前10個(gè)基因。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果

基因表達(dá)芯片GSE9103應(yīng)用R語(yǔ)言分析后，在年輕組和老年組分別篩選出25個(gè)DEGs，在年輕組中，相較于久坐組，訓(xùn)練組8個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，17個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào) （FC≥2，P＜ 0.05）。在老年組中，相較于久坐組，訓(xùn)練組10個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，15個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào) （FC≥2，P＜ 0.05）。利用火山圖 （圖1） 分析和觀察FC值2倍以上變化的mRNA的分布及統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)C值2倍以下或者P＞ 0.05的基因標(biāo)注為灰色，表達(dá)下調(diào)的基因標(biāo)注為藍(lán)色，表達(dá)上調(diào)的基因標(biāo)注為紅色。將年輕組和老年組篩選出的DEGs繪制韋恩圖，如圖2所示，共有9個(gè)基因?yàn)?組群體共有的DEGs，包括ACTN3、AFAP1L1、CALML6、CKB、G0S2、IGFN1、LDHB、PDLIM5和SLC38A1。

2.2 DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)總的DEGs進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析后，結(jié)果如圖3所示，GO富集分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要定位在線粒體、細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，分子功能主要涉及細(xì)胞對(duì)饑餓的反應(yīng)、乳酸代謝過(guò)程以及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等；KEGG分析顯示，DEGs主要與胰高血糖素信號(hào)通路、細(xì)胞緊密連接和AMPK信號(hào)通路有關(guān)。

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

通過(guò)STRING得到的PPI網(wǎng)絡(luò)由40個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白以及86條相互作用關(guān)系構(gòu)成 （enrichmentP＜ 0.000 01），將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape本地版，根據(jù)degree和log2FC大小2個(gè)因素美化PPI網(wǎng)絡(luò) （圖4A）。通過(guò)MCODE插件分析發(fā)現(xiàn)1組集簇，此集簇包含9個(gè)節(jié)點(diǎn) （node） 與16條連線 （edge） （圖4B）。通過(guò)cytoHubba插件按照MCC為標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出處于關(guān)鍵位置的10個(gè)基因（圖5），分別為THRSP、MYH8、MYH1、PDK4、IGFN1、CALML6、PRKAG3、G0S2、ACTN3和FOXO1 10個(gè)關(guān)鍵基因。

圖1 運(yùn)動(dòng)組和非運(yùn)動(dòng)組mRNA差異表達(dá)火山圖分析Fig.1 Differentially expressed genes between trained and sedentary subjects

圖2 年輕組和老年組篩選出的差異表達(dá)基因韋恩圖分析Fig.2 The Venn graph of DEGs in young and old human subjects

3 討論

研究［3］顯示，身體長(zhǎng)期或短期不活動(dòng)都會(huì)對(duì)肌肉性能產(chǎn)生負(fù)面作用，并與胰島素敏感性降低、有氧能力下降和基礎(chǔ)代謝率降低有關(guān)。肌肉力量隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，增加體育活動(dòng)是目前已知的唯一能減輕這種下降趨勢(shì)的方法［11］。有氧運(yùn)動(dòng)除了對(duì)機(jī)體健康有益外，還可以改善某些慢性疾病的癥狀，如體育活動(dòng)對(duì)預(yù)防和 （或） 維持血糖控制及心血管危險(xiǎn)因素有積極作用；在進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)之后，腦卒中和帕金森病患者除了在心肺健康方面有所改善外［12］，在行走、功能和運(yùn)動(dòng)能力方面也有改善［13-14］。目前，有關(guān)有氧運(yùn)動(dòng)與機(jī)體基因表達(dá)之間的關(guān)系及其促進(jìn)健康、預(yù)防疾病的分子機(jī)制的研究較少，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分別對(duì)年輕人和老年人2個(gè)年齡段中運(yùn)動(dòng)組和非運(yùn)動(dòng)組股外側(cè)肌活檢樣本基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析，篩選出的DEGs生物學(xué)功能主要涉及細(xì)胞對(duì)饑餓的反應(yīng)、乳酸代謝過(guò)程、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，KEGG分析顯示主要與胰高血糖素信號(hào)通路、細(xì)胞緊密連接和AMPK信號(hào)通路有關(guān)。

PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出THRSP、MYH8、MYH1、PDK4、IGFN1、CALML6、PRKAG3、G0S2、ACTN3和FOXO1這10個(gè)關(guān)鍵基因。其中，THRSP被稱為甲狀腺激素應(yīng)答點(diǎn)14蛋白，是脂質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)基因，可被甲狀腺激素和高糖飲食等刺激脂質(zhì)合成的因子迅速上調(diào)，參與組織中的脂質(zhì)合成調(diào)控［15］；MYH8和MYH1編碼肌球蛋白重鏈，參與肌肉的合成［16］；PDK4增加胰島素抵抗，升高血糖，減少非酯化脂肪酸水平，是線粒體能量代謝的調(diào)控因子［17］；IGFN1參與成肌細(xì)胞融合和分化［18］；CALML6的有關(guān)研究相對(duì)較少；G0S2為脂質(zhì)代謝調(diào)控分子，PRKAG3是AMPK的調(diào)節(jié)亞基，在骨骼肌中有特異性表達(dá)，有研究［19-20］顯示PRKAG3和G0S2均在AMPK影響葡萄糖或脂類相關(guān)代謝中發(fā)揮重要作用；ACTN3基因已經(jīng)被證實(shí)為運(yùn)動(dòng)基因，編碼一種α輔肌動(dòng)蛋白，不僅與速度有關(guān)，而且也與耐力和力量有關(guān)，關(guān)于該基因的多態(tài)性的研究較多，其中某些基因型是成為優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員的一種特殊標(biāo)志［21］；FoxO1作為Forkhead蛋白家族的成員，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、自噬、凋亡等作用的功能蛋白［22］。

圖3 對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分分子功能的富集信息以及參與的細(xì)胞通路分析Fig.3 Functional and signaling pathway analysis of DEGs，including biological process，cellular component，molecular function and KEGG pathway

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和集簇模塊構(gòu)建Fig.4 Protein-protein interaction network construction and module analysis

圖5 cytoHubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的前10個(gè)基因Fig.5 The top 10 hub genes in the PPI network selected by cytoHubba

以上的這些基因都不同程度地參與了運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用，而本研究獲得的結(jié)論尚需要更多的研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘，探究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體作用的靶基因，可以為下一步的機(jī)制研究提供參考。