脈沖射頻通過調(diào)控Nrf2的表達(dá)減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機(jī)械痛敏

樊修元，陶學(xué)恕，奚奇，王品瑩，宋濤

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院疼痛科，沈陽 110001）

神經(jīng)病理性疼痛 （neuropathic pain，NP）［1］是由周圍或神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病所引起的疼痛，臨床表現(xiàn)為自發(fā)痛、痛覺過敏、痛覺超敏和感覺異常。NP是臨床疼痛中最常見的類型之一，發(fā)病率高，病理機(jī)制復(fù)雜，治療困難。目前治療NP的主要方法包括藥物、神經(jīng)阻滯、神經(jīng)調(diào)控［包括脈沖射頻 （pulse radiofrequency，PRF） 及脊髓電刺激術(shù)］、手術(shù)干預(yù)等［2-3］。PRF是一種非神經(jīng)毀損性的射頻技術(shù)［4］。PRF具有作用顯著、創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少等優(yōu)勢，近年來已成為臨床上治療NP的主流手段。但是，目前PRF的作用機(jī)制尚未明確。

研究［5］顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)在中樞敏化中發(fā)揮著重要作用。許多神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病等的病因與氧化應(yīng)激及損傷有關(guān)。氧化應(yīng)激反應(yīng)也同時參與外周神經(jīng)損傷引起的NP。核因子E2相關(guān)因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2） 是Cap-n-Collar家族的成員。其結(jié)構(gòu)中的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域Neh1能與抗氧化效應(yīng)元件綁定，調(diào)控多種抗氧化酶的表達(dá)，作為機(jī)體自身天然的抗氧化防御體系，對抗機(jī)體中過多自由基的損害，發(fā)揮自身防御和修復(fù)的作用［6］。

本研究采用大鼠坐骨神經(jīng)分支損傷（spared nerve injury，SNI） 模型，觀察PRF治療后SNI大鼠疼痛行為學(xué)的改變及脊髓中Nrf2表達(dá)的變化，探討PRF可能的鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量180～220 g，由遼寧長生生物公司提供，分籠飼養(yǎng)于22～24 ℃、12 h明暗交替的環(huán)境中，自由取食。本動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn) （IACUC no.2019091）。

1.1.2 主要試劑及儀器：Nrf2 （英國Abcam公司），GAPDH內(nèi)參抗體 （美國Proteintech公司），SDS-PAGE快速凝膠試劑盒 （江蘇凱基生物技術(shù)公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒 （杭州弗德生物技術(shù)公司），RIPA裂解液 （美國Beyotime生物技術(shù)研究所），蛋白酶抑制劑 （美國Roche公司）。射頻控溫?zé)崮?（R-2000B A1，美國北琪公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SNI疼痛模型建立：參照DECOSTERD等［7］的方法建立大鼠SNI疼痛模型。3%異氟烷麻醉大鼠，取右后肢建立SNI模型，所有手術(shù)操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.2.2 大鼠疼痛行為學(xué)測定：參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行大鼠機(jī)械痛閾的檢測。將大鼠置于網(wǎng)狀底部的籠子中，將校準(zhǔn)的纖毛Von Frey細(xì)絲垂直作用于后爪，直到觀察到陽性反應(yīng) （縮回、舔或搖動爪子） 為止。使用“up and down”方法確定大鼠機(jī)械縮足閾值 （paw withdrawal threshold，PWT）。運(yùn)用公式對測得的痛閾值進(jìn)行校正。

1.2.3 Western blotting：用于測定樣品中Nrf2蛋白表達(dá)情況。大鼠經(jīng)5%七氟烷麻醉處死，快速斷頭，在冰浴中快速取出右側(cè)L4～6脊髓，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液400 μL勻漿，0 ℃孵育30 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min。收集上清液，蛋白定量，上樣行SDS-PAGE凝膠電泳，100 V、90 min轉(zhuǎn)至PVDF膜。在室溫下，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加一抗［兔抗大鼠 Nrf2 （1︰1 000）、GAPDH （兔源1︰2 000）］，4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯影曝光 （Image Lab凝膠成像分析儀處理系統(tǒng)成像）。Nrf2蛋白與內(nèi)參的灰度比值表示Nrf2蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4 大鼠分組： （1） 按照隨機(jī)分組的原則，將18只大鼠隨機(jī)分為正常組和SNI模型組，正常組不做任何處理，根據(jù)術(shù)后的時間再將SNI模型組分為1 d、3 d、7 d、10 d、14 d組，每組3只。檢測各組大鼠PWT。分別于術(shù)后1 d、3 d、7 d、10 d、14 d處死相應(yīng)SNI組大鼠，正常組與SNI14 d組一同處死。測量大鼠脊髓中Nrf2的表達(dá)情況。（2） 為了研究PRF治療對SNI大鼠脊髓Nrf2表達(dá)的影響，另取9只SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組 （暴露SD大鼠的坐骨神經(jīng)，放置無脈沖的射頻針5 min后，逐層縫合）、SNI組和PRF組 （SNI建模14 d后再次暴露大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)損傷處行PRF治療，PRF參數(shù)設(shè)為20 ms、2 Hz、45 V，溫度不高于42 ℃，5 min后逐層縫合），每組3只。在PRF治療后第9天處死各組大鼠，檢測各組大鼠脊髓中Nrf2的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NP對大鼠PWT的影響

SNI模型建立后，與正常組相比，SNI模型組PWT顯著降低，提示NP可降低大鼠的PWT。見表1。

2.2 NP對大鼠脊髓背角中Nrf2表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，SNI1 d組大鼠脊髓背角中Nrf2蛋白表達(dá)水平 （0.28±0.06） 最高，其后隨時間推移逐漸減少 （SNI3 d組：0.19±0.03；SNI7 d組：0.13±0.02；SNI10 d組：0.12±0.02；SNI14 d組：0.05±0.00），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

2.3 PRF治療對NP大鼠PWT的影響

治療前各組大鼠的PWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05）。PRF組大鼠從治療后第1天開始PWT逐漸升高；PRF組治療后第9天，PWT顯著高于SNI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見表2。

2.4 PRF治療對NP大鼠脊髓中Nrf2表達(dá)的影響

PRF治療后第9天，對各組大鼠脊髓中Nrf2的表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRF組Nrf2的表達(dá)水平（0.43±0.04） 較SNI組 （0.29±0.02） 明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。假手術(shù)組Nrf2的表達(dá)量（0.70±0.04） 較SNI組、PRF組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見圖2。

表1 SNI模型組與正常組大鼠機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值的比較 （，g）Tab.1 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in each group （，g）

表1 SNI模型組與正常組大鼠機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值的比較 （，g）Tab.1 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in each group （，g）

NC，normal control；SNI，spared nerve injury.

圖1 SNI模型組大鼠脊髓中Nrf2蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of Nrf2 protein in spinal dorsal horn of rats in SNI group

3 討論

研究［9］顯示，SNI模型大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)與人類NP相似。KIASALARI等［10］發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可促進(jìn)NP的發(fā)生。而Nrf2是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，可以減輕NP［6，11］。Nrf2基因敲除鼠因發(fā)生腎小球腎炎等炎癥，死亡率高于正常鼠，提示Nrf2在炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［12］。

PRF以其獨(dú)特的優(yōu)勢成為治療慢性疼痛的重要的微創(chuàng)鎮(zhèn)痛技術(shù)。該技術(shù)利用高能量脈沖式電流，刺激靶向神經(jīng)組織，通過干擾神經(jīng)信號通路及可逆性抑制神經(jīng)元突觸，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛作用確切［13-18］，但其機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，SNI大鼠PWT在神經(jīng)損傷后第1天顯著下降，并隨時間的推移逐漸下降，在SNI14 d時維持在較低的水平。進(jìn)行PRF治療后，與SNI組相比，PRF組大鼠PWT明顯上調(diào)，且在PRF治療后第9天2組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）。提示PRF能夠提高SNI大鼠的機(jī)械痛域，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。分子水平上，SNI模型大鼠脊髓中Nrf2的表達(dá)水平在損傷后第1天略有增加，而后開始逐漸減少。提示Nrf2可能在NP早期發(fā)揮保護(hù)作用。PRF治療后第9天，與SNI組相比，PRF組大鼠脊髓中Nrf2表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。提示PRF治療可增加SNI大鼠脊髓中Nrf2的表達(dá)水平，Nrf2可能在減輕外周神經(jīng)損傷大鼠的疼痛中發(fā)揮一定作用。由此推測PRF治療可影響SNI大鼠脊髓中抗氧化物的表達(dá)，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

表2 SNI組、假手術(shù)組、PRF組大鼠機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值的比較 （，g）Tab.2 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in SNI，sham，and PRF groups （，g）

表2 SNI組、假手術(shù)組、PRF組大鼠機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值的比較 （，g）Tab.2 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in SNI，sham，and PRF groups （，g）

1） P ＜ 0.05 vs SNI group.

綜上所述，PRF治療可提高SNI大鼠模型的PWT，并使其脊髓中Nrf2表達(dá)上調(diào)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖2 3組大鼠脊髓中Nrf2蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of Nrf2 protein in rats’spinal dorsal horn among 3 groups