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    腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和克隆的影響

    2020-06-23 05:53:16孔繼昌王恩艷張巍戴坤鵬劉少云付永杰郭志強(qiáng)
    實(shí)用老年醫(yī)學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)皮細(xì)胞克隆通路

    孔繼昌 王恩艷 張巍 戴坤鵬 劉少云 付永杰 郭志強(qiáng)

    近年來(lái),老年人群中CHD、腦血管意外等心腦血管疾病發(fā)病率越來(lái)越高,已經(jīng)成為威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一,其中動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)被認(rèn)為是心腦血管疾病重要的病理基礎(chǔ)和直接誘因[1]。AS 能夠廣泛侵襲全身血管,造成器官損傷,引起多種疾病的發(fā)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為機(jī)體重要的代謝和內(nèi)分泌器官,其結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能受損在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。多篇文獻(xiàn)報(bào)道,腦源性生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)參與調(diào)節(jié)多種內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化,作為一種新的促血管新生因子,其能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的血管新生[2]。最近有研究發(fā)現(xiàn),在T2DM 合并頸動(dòng)脈粥樣硬化病人的血清中,BDNF水平降低,暗示血清低水平的BDNF 可能參與頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展[3]。因此,本研究以人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human coronary artery endothelial cells,HCAEC)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探討B(tài)DNF對(duì)HCAEC功能的影響及可能的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 HCAEC 系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);重組人源BDNF 蛋白購(gòu)自ProSpec 公司;RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)自HYCLONE 公司;胎牛血清、雙抗和0.25%胰酶消化液購(gòu)自Gibco 公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting Kit-8,CCK8)購(gòu)自北京索萊寶公司;兔抗人蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(Phospho-Akt,p-Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR(Phospho-mTOR,p-mTOR)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(Phospho-ERK1/2,p-ERK1/2)、Wnt 蛋白家族1(Wnt family member 1,Wnt1)、跨膜受體卷曲蛋白1(Frizzled1)、胞漿調(diào)節(jié)散亂蛋白1(dishevelled segment polarity protein 1 pseudogene 1,Dsh)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的抗兔IgG 抗體均購(gòu)自Abcam 公司;細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理:HCAEC 置于含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(0.1 mg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)液中,于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為2 組,實(shí)驗(yàn)組加BDNF(50 ng/μL),對(duì)照組不做其他處理。

    1.2.2 CCK8增殖實(shí)驗(yàn):2組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,消化細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),取100μL細(xì)胞懸液,以每孔1×103個(gè)/mL 細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)接種到96 孔板中,每隔24 h檢測(cè)1 次細(xì)胞活力,共檢測(cè)4 次,檢測(cè)前每孔加10μL CCK8 試劑,37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,使用酶標(biāo)儀用450 nm激發(fā)光檢測(cè)OD值,繪制增殖曲線。

    1.2.3 平板單克隆形成實(shí)驗(yàn):2 組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后,加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞10 min,用RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化,制備細(xì)胞懸液,按照2×103個(gè)/mL 細(xì)胞數(shù)接種到100 mm 培養(yǎng)皿中,實(shí)驗(yàn)組加入含BDNF(50 ng/μL)的RPMI-1640 培養(yǎng)液,對(duì)照組加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),3 d后更換培養(yǎng)液,再培養(yǎng)2 d,4%甲醛固定10 min,結(jié)晶紫染色20 min,顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法為:顯微鏡下任意選取5 個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)單克隆數(shù)目,取5 個(gè)視野的平均數(shù)為最后結(jié)果。

    1.2.4 免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平:2 組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后,加RIPA 裂解液(使用前加入蛋白酶抑制劑)裂解提取蛋白,取適量蛋白液適度稀釋,通過(guò)BCA 法測(cè)定濃度,剩余蛋白液加入LDS sample buffer 煮沸5 min。配制10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠,20μg/孔加入蛋白樣品,轉(zhuǎn)膜至硝化纖維素膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過(guò)夜,快速?zèng)_洗掉一抗,TBST 緩沖液洗3 次,每次5 min,二抗室溫孵育1 h,TBST 緩沖液洗3 次,每次5 min,加ECL 顯色。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。采用Image J 分析所得圖像,以目的蛋白/GAPDH灰度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,2組間比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 2 組HCAEC 增值能力比較 CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)24 h 后,2 組細(xì)胞OD 值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)48、72 h后,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞OD值均顯著增加(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 2組細(xì)胞增殖能力比較(±s,n=3)

    表1 2組細(xì)胞增殖能力比較(±s,n=3)

    注:與對(duì)照組比較,*P <0.05,**P <0.01

    72 h 0.8043±0.0573 1.1389±0.0747**組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組0 h 0.2440±0.0415 0.2470±0.0101 24 h 0.3800±0.0330 0.4521±0.0441 48 h 0.5520±0.0671 0.7134±0.0638*

    2.2 2組HCAEC 克隆形成能力比較 單克隆平板形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)5 d后,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目為(228±13)個(gè),與對(duì)照組相比[(85±7)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.776,P<0.05)。

    2.3 2 組PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路關(guān)鍵組分Akt 和mTOR 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但p-Akt、p-mTOR 水平較對(duì)照組顯著增加(P均<0.05)見(jiàn)表2。

    表2 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平(±s,n=3)

    表2 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平(±s,n=3)

    注:與對(duì)照組比較,*P <0.05,**P <0.01

    p-mTOR 0.413±0.069 0.584±0.059*組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組Akt 0.767±0.082 0.704±0.043 p-Akt 0.469±0.046 0.903±0.075**mTOR 0.734±0.059 0.769±0.069

    2.4 2 組ERK 信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 結(jié)果表明,2 組細(xì)胞中的ERK 信號(hào)通路關(guān)鍵組分ERK1/2 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.609±0.032)比(0.587±0.044),t=0.7179,P=0.5125];而實(shí)驗(yàn)組p-ERK1/2 表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高[(0.377±0.022)比(0.547±0.051),t= 5.3766,P=0.0058]。

    2.5 2 組Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組Wnt/β-catenin 信 號(hào) 通 路 相 關(guān) 蛋 白Wnt1、Frizzled1 和Dsh的蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)表3。

    表3 2組Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較(±s,n=3)

    表3 2組Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較(±s,n=3)

    注:與對(duì)照組比較,**P <0.01

    Dsh 0.339±0.043 0.690±0.041**組別對(duì)照組BDNF組Wnt1 0.086±0.060 0.364±0.053**Frizzled1 0.701±0.029 1.125±0.081**

    3 討論

    研究表明,BDNF在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和再生、損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。Guan等[6]研究發(fā)現(xiàn),BDNF 在腦出血后表達(dá)上調(diào),能夠促進(jìn)神經(jīng)再生和血管生成。目前,BDNF 已經(jīng)表現(xiàn)出了對(duì)PD[7]、AD[8]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療潛力。另有研究表明,BDNF 在HUVECs 和人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種內(nèi)皮細(xì)胞以及新生血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá),參與維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活[9],促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移并抑制細(xì)胞衰老和凋亡,促進(jìn)血管新生[10]。但目前尚無(wú)BDNF 對(duì)HCAEC 功能的影響及其作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),外源添加BDNF 處理可明顯促進(jìn)HCAEC 的增殖和克隆能力,與在HUVECs 中發(fā)揮的功能類似。然而,BDNF 調(diào)節(jié)HCAEC 增殖和克隆能力的具體分子機(jī)制和所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還尚未清楚。

    PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是生物體內(nèi)關(guān)鍵的信號(hào)通路,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、存活和凋亡等生理活動(dòng)[11]。在HUVECs 中,BDNF 就是通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)HUVECs 的體外遷移和存活[2]。本研究發(fā)現(xiàn),BDNF 處理增加了Akt 和m-TOR 蛋白的磷酸化水平,促進(jìn)了PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的活化,提示PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路可能參與了BDNF誘導(dǎo)的HCAEC增殖和克隆。ERK1/2是一個(gè)能夠介導(dǎo)血管新生的重要的信號(hào)蛋白,在HUVECs 中,ERK1/2 被BDNF 誘導(dǎo)磷酸化,參與了HUVECs 細(xì)胞增殖[2]。本研究發(fā)現(xiàn),BDNF 處理同樣增加了HCAEC 中ERK1/2蛋白的磷酸化水平,因此,ERK 信號(hào)通路也可能參與了BDNF促進(jìn)HCAEC增殖的過(guò)程。

    Wnt/β-catenin 信號(hào)通路也是一條生物發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡等生理活動(dòng)的關(guān)鍵信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與了BDNF 誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)元干細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程[12-13]。因此,本研究分析了HCAEC 中BDNF與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系。結(jié)果表明,BDNF 處理組細(xì)胞中的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt1、Frizzled1 和Dsh 的表達(dá)水平升高,提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號(hào)通路可能也參與了BNDF誘導(dǎo)的HCAEC 增殖和克隆過(guò)程。那PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、ERK 信號(hào)通路和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路具體是如何參與BDNF 對(duì)HCAEC 增殖和克隆的誘導(dǎo)過(guò)程的呢?這三條信號(hào)通路是否有相互聯(lián)系?這將是我們下一步深入研究的重點(diǎn)。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)BDNF 能夠誘導(dǎo)HCAEC的增殖和克隆,可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路、ERK 信號(hào)通路和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究揭示了BDNF 在HCAEC 生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要意義,為將來(lái)BDNF在AS臨床治療中的應(yīng)用提供了參考。

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